Método de extracción de ácidos nucleicos: fases y pretratamiento de la muestra

1. Pretratamiento de la muestra

2. Extracción de ácidos nucleicos

3. Purificación de los ácidos nucleicos

Sangre: Se realiza con sangre anticoagulada con EDTA. • La extracción de ácidos nucleicos debe realizarse durante las 24 horas siguientes. • Se puede mantener en refrigeración hasta 5 días a 4ºC

Detergente: componente principal. Su función es desestructurar las membranas y desnaturalizar las proteínas. Desestabilizan la bicapa lipídica de la membrana celular y liberan el contenido citoplasmático y nuclear al medio. El más usado es Dodecil-sulfato-sódico con EDTA

EDTA: el magnesio impide que actúen las ADNasas, al atrapar los cationes de Mg, el EDTA impide que actúen estas enzimas.

Proteasas: digieren las proteínas y facilitan la rotura y la disolución de las membranas. También, eliminan las nucleasas.

Agentes caotrópicos: inactivan nucleasas, tanto DNAsas como RNAasas, desnaturalizándolas. Agente caotrópico es una sustancia que desorganiza la interacción de las moléculas de agua con otros solutos.

Verificación de lisis • La obtención de una solución homogénea es indicativa de un buen resultado de la lisis. • Si aparecen grumos, cuerpos celulares, etc., significará que la lisis no ha sido eficiente. Si es así, habrá que añadir más solución de lisis y volver a incubar. • Si queremos purificar ADN, es necesario eliminar ARN. Para ello hay que añadir enzima ARNasa y se incuba a 37ºC durante 15-45min. • En sangre no es necesario porque el ARN es mínimo, pero sí en saliva, tejidos y raspados celulares.

Purificación con solventes orgánicos 1. Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos: . 2. Precipitación del ADN: 3. Lavado de ADN:. 4. Resuspensión del ADN.

Precipitación con sales: Precipitación de proteínas: 2. Precipitación de ADN: 3. Lavado y resuspensión del ADN:

La calidad de los ácidos nucleicos purificados viene determinada por tres parámetros: INTEGRIDAD, PUREZA Y CONCENTRACIÓN

Células mononucleadas de sangre periférica: LINFOCITOS Y MONOCITOS.

¿En cuál de los siguientes casos se puede utilizar sangre anticoagulada con EDTA? Extracción de ácidos nucleicos.

Los ácidos nucleicos son:  Más solubles en etanol que en isopropanol.