Métodos de Análisis y Manipulación de Ácidos Nucleicos: Desde la Electroforesis hasta el Marcaje de Sondas

Comprobación de la Integridad de los Ácidos Nucleicos Purificados

Para comprobar la integridad de los ácidos nucleicos purificados, se realiza una electroforesis.

¿Qué resultado se observará en una muestra de ARN?

En ARN, se forman bandas definidas correspondientes a los ARNr (ARN ribosómico). Además, siempre aparecerá una estela en la columna que es debida al ARNm (ARN mensajero).

Medición de la Turbidez de la Muestra

¿Cómo se comprueba la turbidez de la muestra?

La turbidez de la muestra se comprueba gracias a la absorbancia a 320 nm.

De tener mucha turbidez, ¿cómo crees que se podría solucionar?

En caso de tener mucha turbidez, tendremos que aplicar otro método de purificación para poder eliminar los contaminantes y rebajar su turbidez para aumentar la pureza de la muestra y, con ello, su calidad.

Unidad de Medida de la Concentración de Ácidos Nucleicos

La unidad más común para medir la concentración es ng/µl (nanogramos por microlitro).

Gráfica de Desnaturalización del ADN

La curva obtenida es de tipo sigmoide, presenta un punto de inflexión, al 50% de desnaturalización. La temperatura correspondiente se llama temperatura de fusión (Tm) y es directamente proporcional al porcentaje de bases C (citosina) y G (guanina), unidas por triple enlace. En la curva de la gráfica se diferencian tres regiones:

1. Región A: Zona de comienzo de desnaturalización. Su altura depende de la concentración del ácido nucleico. Es casi constante (plana) ya que a esas temperaturas apenas hay desnaturalización.
2. Región B: Zona de crecimiento. A su vez, tiene dos partes: la primera, convexa, en la que la desnaturalización aumenta exponencialmente hasta llegar a la Tm. A partir de ahí, el aumento será ralentizado, dando lugar a una curva cóncava.
3. Región C: La desnaturalización se para casi por completo, ya que quedan pocos pares de bases por separarse. La gráfica, por tanto, será casi horizontal.

Tipos de Sondas de ADN

Según el proceso de obtención, las sondas de ADN pueden ser de síntesis química, de ADN recombinante y de PCR.

• De síntesis química: Se producen mediante condensación secuencial de los nucleótidos de interés. Se añaden uno a uno en el orden adecuado. Son monocatenarias, por lo que penetran fácilmente los tejidos. Sin embargo, tienden a hibridar rápidamente de forma inespecífica debido a su pequeño tamaño.
• Sondas de ADN recombinante: Son de gran tamaño, por lo que su especificidad y sensibilidad son muy altas. Son de ADN bicatenario, por lo que requieren desnaturalización. Para su producción, se introduce la secuencia en un plásmido que posteriormente se incluye en un cultivo bacteriano, se deja crecer el cultivo y finalmente se purifica el plásmido y se extraen las sondas con enzimas de restricción.
• Sondas por PCR: Son bicatenarias de tamaño intermedio. Se producen en grandes cantidades en poco tiempo. Deben conocerse las secuencias que flanquean a la diana.

Marcaje por Desplazamiento en Mella y Cebado al Azar

¿En qué se basa el marcaje por desplazamiento en mella?

El marcaje por desplazamiento en mella se aplica a sondas de ADN de gran tamaño. A la sonda se le aplica ADNasa, que realizará cortes aleatorios. A continuación, se añaden nucleótidos, de los cuales un tipo estará marcado, y ADNpol (ADN polimerasa). Las sondas se reconstruirán incluyendo ahora los nucleótidos marcados.

¿En qué se diferencia del cebado al azar o aleatorio?

El cebado al azar o aleatorio es también empleado en sondas de ADN de gran tamaño. Se desnaturalizan las sondas y se agregan hexámeros, secuencias de seis nucleótidos. Los hexámeros se unen al azar a ambas cadenas y posteriormente se añaden nucleótidos, uno de los tipos marcado, y ADNpol. Se reconstruyen las sondas incluyendo los nucleótidos marcados.

Marcaje de Sonda con Isótopos Radiactivos y Fluorocromos

Marcaje de sonda con isótopos radiactivos: Se sustituyen átomos de la sonda por isótopos radiactivos (³²P y ³H). Mediante autorradiografía se puede observar el resultado.

Fluorocromos: Se añaden a la sonda para que emita luz visible al someterlas a la luz UV. Se emplean moléculas de la familia Alexa-fluor y cianinas. Requieren microscopios de fluorescencia para su observación.