Métodos Avanzados para la Obtención y Evaluación de Linfocitos

Técnicas de Separación de Linfocitos

La técnica más utilizada es la separación por centrifugación en gradiente de Ficoll. La sangre total desfibrinada se diluye en un medio de cultivo y se vierte sobre un tubo lleno hasta la mitad de un medio con Ficoll. Seguidamente se centrifuga y se consigue mediante la técnica siguiente la separación de los linfocitos.

Con esta técnica se separan los leucocitos mononucleares (linfocitos y monocitos), pero como los monocitos son mucho menos en sangre periférica, se considera que se puede conseguir la separación de los linfocitos.

1. Medio de Separación

El medio de separación está formado por dos compuestos:

• Ficoll 400: Es un polímero sintético de sacarosa y epiclorhidrina. Tiene una densidad mayor que la de los linfocitos, pero menor que el resto de las células, y además provoca la aglutinación de los hematíes.
• Diatrizoato de sodio: Es un compuesto que, mezclado con el Ficoll, forma soluciones de baja viscosidad y alta densidad, lo que favorece la separación de las células.

Preparación del Medio

Se prepara siguiendo estos pasos:

1. Preparar solución al 14% de Ficoll 400.
2. Mezclar la solución con diatrizoato en la proporción adecuada.
3. Ajustar la densidad y la osmolaridad.
4. Esterilizar por filtración.
5. Conservar a 4ºC en oscuridad.

2. Fundamento de la Separación

La centrifugación de la sangre total que se deposita sobre el medio de separación provoca los siguientes efectos:

• Los granulocitos, que son más densos que el medio de separación, caen al fondo.
• Los eritrocitos se aglutinan y los aglutinados caen al fondo del tubo.
• Las células mononucleares se quedan en la interfase entre los dos líquidos debido a que tienen una densidad menor.

Tras la centrifugación se observan 3 capas:

1. Una banda superior que es el plasma.
2. Una banda intermedia que es blanca y contiene las células mononucleares.
3. Una banda inferior rojiza donde están los glóbulos.

3. Procedimiento de Separación

El procedimiento de separación es el siguiente:

1. Preparar el medio de separación de Ficoll.
2. Preparar la sangre.
3. Añadir con cuidado la sangre sobre el medio de separación.
4. Centrifugar 20 minutos.
5. Eliminar la fase superior con una pipeta Pasteur.
6. Depositar la segunda capa (intermedia) en un tubo limpio.
7. Resuspender en el tubo limpio con más medio.
8. Lavar mediante centrifugación.
9. Añadir un medio de conservación que suele ser una solución salina con suero bovino al 10%.
10. Cuantificar las células y hacer el recuento.

Estudio de la Funcionalidad de los Linfocitos B

Los linfocitos pueden ser inducidos a dividirse in vitro mediante una gran variedad de estímulos. Esta capacidad se utiliza para evaluar su funcionalidad.

Estas determinaciones in vitro reflejan los mecanismos de activación celular y la capacidad de la respuesta inmunológica. La determinación de la producción de anticuerpos (Ac) también es un parámetro de evaluación de la funcionalidad de los linfocitos B y contribuye al diagnóstico de distintas inmunodeficiencias.

Se cuantifican los niveles de IgG, IgM e IgA por medio de diversos métodos, uno de los más utilizados es la Inmunodifusión radial y la turbidimetría.

Cuantificación de los Linfocitos

Los linfocitos son morfológicamente indistinguibles; hay que utilizar métodos de laboratorio para detectar proteínas de membrana y así diferenciar unos linfocitos de otros.

Diferenciación de Subpoblaciones

• Tradicionalmente, los linfocitos T y B se han separado por técnicas de inmunofluorescencia directa.
• La citometría de flujo ofrece amplias posibilidades, aunque tiene el inconveniente del coste del instrumento, la complejidad de su manejo y de mantenimiento.
• En la cuantificación de linfocitos T, además de la citometría de flujo, hay otras opciones, como la formación de rosetas-E.

Técnica de Rosetas-E

Es una técnica barata y fácil de poner en práctica en cualquier laboratorio. Los linfocitos T poseen en su superficie una molécula que les permite unirse a los eritrocitos de carnero in vitro formando agrupaciones llamadas rosetas-E. Solo los linfocitos T viables son capaces de formar estas rosetas.

Evaluación de la Actividad Microbicida

Se incuban con una cantidad conocida de microorganismos (bacterias o levaduras); posteriormente, se realiza un recuento de la viabilidad residual de ese agente microbiano.

La disminución del número de UFC (Unidades Formadoras de Colonias) nos indica la eliminación por parte de los fagocitos. Este método tiene la ventaja de que no solo examina la capacidad fagocítica, sino que evalúa la capacidad destructiva sobre ellos.