Métodos de Desinfección y Esterilización en el Laboratorio

Limpieza de Buretas

Se deben lavar con agua del grifo o con agua jabonosa con ayuda de una escobilla. Si la suciedad es resistente, hay que utilizar productos especiales. Después, aclararlas con agua del grifo hasta retirar todo el jabón. Por último, llenar con agua destilada la tercera parte de su capacidad, inclinarlas y agitar el contenido para mojar todo el interior de la bureta. Una vez limpia, se sujeta al soporte con las pinzas en posición invertida y con la llave abierta para que se seque a temperatura ambiente. No meterse en estufa porque mata el volumen. Si al llenar la bureta con la solución aparecieran burbujas de aire en las paredes interiores, si la solución no fluye suavemente o hay pequeñas gotas en el interior de la superficie, significa que no está limpia y no transferirá la cantidad exacta del líquido. Tras su limpieza, hay que proceder al curado de la bureta, ya que en sus paredes interiores permanece adherida cierta cantidad de agua destilada, de modo que la solución que se introdujera se diluiría y cambiaría su concentración. Si se comprueba que la disolución no fluye suavemente por el extremo, es posible que se deba a que el paso está obstruido por un pequeño trozo de material sólido o un poco de grasa en la llave. Este tipo de obstrucciones puede eliminarse con un alambre fino. Finalmente, hay que desmontarla periódicamente y retirar la llave para limpiarla mejor, aplicándole un producto graso como vaselina o parafina que gire suavemente.

Métodos de Desinfección

Proceso que elimina la mayoría de microorganismos de los objetos inanimados, con la excepción de los virus y las esporas bacterianas, y que puede llevarse a cabo a través de métodos físicos y químicos.

Métodos Físicos

Mediante la utilización del calor se puede realizar:

• La Ebullición: Proceso en el cual el agua hierve a 100ºC, aunque no constituye un método esterilizante al no destruir los virus ni muchas de las esporas bacterianas.
• La Pasteurización: Proceso que consiste en exponer el material a agua caliente a unos 77º durante 30 minutos. Propósito: destruir todos los microorganismos patógenos, excepto virus y esporas bacterianas.

Métodos Químicos

Se emplean desinfectantes, sustancias químicas que destruyen gérmenes o microorganismos patógenos y no patógenos, a excepción de virus y esporas bacterianas o formas de resistencia de las bacterias.

Cualidades de un Buen Desinfectante

• No ser tóxico para el manipulante.
• No corrosivo de los materiales que se vayan a desinfectar.
• Tener amplio espectro, que destruya o inactive el mayor número de microorganismos.
• Ser de acción rápida y duradera.
• Ser estable y que no se descomponga o inactive al mezclarse con agua ni se solubilice fácilmente con ella.
• Poseer estabilidad química: que no se inactive ante la presencia de materia orgánica.
• Ser de fácil manipulación y además económico.

Tipos de Desinfectantes

Desinfectante: Sustancia que se aplica sobre objetos inanimados como material de laboratorio, paredes, suelos o mobiliarios, y que destruyen los gérmenes o microorganismos patógenos y no patógenos, a excepción de virus y esporas bacterianas.

Hipoclorito Sódico (NaHClO)

Desinfectante de amplio espectro, posee acción bactericida y fungicida gracias al cloro que libera, pero se inactiva ante la materia orgánica. La solución acuosa que contiene 50 g/l de cloro libre es la lejía de uso doméstico. Cuando esta solución se diluye al 2% y contiene 1 g/l de cloro libre se utiliza como desinfectante del material de laboratorio, y si es al 10% contendrá 5 g/l de cloro libre y se considerará como desinfectante de nivel alto. Los preparados industriales de lejía vienen muy concentrados (120 g/l), por lo que habrá que diluirlos cuidadosamente hasta obtener las concentraciones deseadas.

• Ventajas: Ser amplio espectro, bastante efectivo y de acción rápida.
• Inconvenientes: Corrosivo de los metales, inestable a la luz y que cuando se diluye se desestabiliza y pierde poder germicida al cabo de unas horas. En presencia de materia orgánica también se inactiva. La lejía debe almacenarse y utilizarse en zonas ventiladas porque el cloro libre es un gas tóxico y hay que evitar mezclarla con ácidos porque se emite cloro gaseoso rápidamente.

Derivados del Fenol: Metil-Fenol

Agente bacteriostático que no destruye las bacterias, pero detiene su crecimiento e inhibe su proliferación, aunque posee un bajo espectro de acción. Se considera desinfectante de nivel intermedio o bajo, por lo que solo puede usarse en materiales no críticos en los que hay bajo riesgo de infección.

• Inconvenientes: La materia orgánica interfiere en su acción y para utilizarse deben protegerse la piel y ojos por ser irritante.

Alcohol Etílico al 70% = Etanol

Es bactericida, destruye bacterias y es eficaz contra la mayoría de las que son patógenas, pero su acción es imprevisible frente a los hongos y a los virus. El etanol es el más utilizado debido a que posee mayor poder desinfectante que el de 96º, pero consigue una escasa desinfección, por lo que su uso se limita a los materiales no críticos y así está indicado para la desinfección de termómetros de baño y para desengrasar portaobjetos y cubreobjetos.

• Inconvenientes: Irrita la piel, inflamable y se evapora.

Categorías de Desinfección

3 niveles:

Alta

Destruye todos los microorganismos con excepción de algunas esporas bacterianas. NaHClO.

Intermedia

Inactiva bacterias vegetativas, hongos y casi todos los virus, pero no las esporas bacterianas. Hexaclorofenol o solución de hipoclorito sódico.

Baja

Sí destruye la mayoría de las bacterias, algunos virus y algunos hongos, pero no afecta a organismos más resistentes como el bacilo de la tuberculosis o las esporas bacterianas. Hay que distinguir entre material crítico o de alto riesgo, que está en contacto con microorganismos y requiere una desinfección alta o esterilización, y el material no crítico o de bajo riesgo, que no está contaminado con microorganismos y requiere una desinfección intermedia o baja.

Métodos de Esterilización

Mediante el proceso de esterilización se consigue la completa destrucción de toda forma de vida microbiana, incluyendo los virus como VIH y hepatitis, y las esporas bacterianas. Se puede llevar a cabo mediante métodos físicos (calor húmedo, calor seco, filtración, radiaciones) y métodos químicos (óxido de etileno, glutaraldehído al 2%).

Métodos Físicos

Por Calor Húmedo

Todos los microorganismos vivos pueden ser destruidos rápidamente con vapor de agua a presión, mediante autoclave, y a través de tyndalización.

A. Autoclave

Aparato que se emplea para obtener materiales estériles, que deben resistir a altas temperaturas, y para esterilizar material desechable contaminado previamente a su eliminación. El aparato genera calor húmedo en forma de vapor de agua a presión y la esterilización se consigue a través del mecanismo de la coagulación de las proteínas, destruyendo así todo tipo de microorganismos, incluyendo virus y esporas. Consta de los siguientes elementos:

• Fuente de calor
• Interruptor general que enciende y apaga el aparato
• Volante que permite la apertura y cierre de la tapa
• Depósito con resistencia eléctrica en el fondo
• Rejilla perforada que se sitúa a la mitad del depósito
• Cestillo para poner el material y que se sitúa encima de la rejilla
• Manómetro indicador de la presión interna y termómetro que indica la temperatura
• Llave de desvaporización o purga
• Válvula de vapor o presión y válvula de seguridad

Por otro lado, a la hora de poner en marcha el autoclave es necesario:

• Abrir la tapa girando el volante de cierre y desplazar con el brazo
• Llenar el depósito con agua destilada hasta la señal, por debajo de la rejilla perforada
• Poner el material encima de la rejilla o en un cestillo de forma que queden espacios entre los materiales para que circule bien el vapor de agua
• No taponar el orificio superior del depósito por donde sale el vapor de agua para esterilizar los materiales
• Desplazar la tapa para que cierre el depósito hasta el tope y girar el volante de cierre para apretarla bien
• Conectar el autoclave a la corriente eléctrica y accionar el interruptor general
• El autoclave irá aumentando la temperatura y empezará a producir vapor de agua que desplaza al aire. Una vez purgado el aire del interior, se cierra la llave de purga y la temperatura que se alcanza en ese momento es de 100º, momento en el que la presión comienza a subir hasta 1 atm y la veremos indicada en el manómetro
• Cuando se alcanzan la temperatura y presión deseadas es cuando comienza el tiempo de esterilización, durante el cual se eliminan todos los microorganismos, incluyendo virus y esporas
• Finalmente, cuando termina el tiempo de esterilización, se desconecta de forma manual o automática, pero no se abre hasta que el manómetro indique 0 de presión y se haya enfriado. Abrir la llave de desvaporización o de purga ayudará a que el vapor salga más rápido y descienda la presión.

• Ventajas: Rápida esterilización, no es tóxica, esteriliza gran variedad de materiales (vidrio, material no oxidable, porcelana, goma y tela), y es económica.
• Desventajas: Hay materiales que no se pueden esterilizar con autoclave, como plástico, sustancias insolubles en agua y material metálico oxidable, además de que solo esteriliza en superficie y no en profundidad.

Precauciones:

• Utilizar agua destilada y no llenar por encima del cestillo con material.
• Poner material encima del cestillo o rejilla, dejando espacios entre los materiales para que circule correctamente el vapor de agua.
• No taponar el orificio superior del depósito por donde sale el vapor.
• Controlar temperatura, tiempo y presión de esterilización.
• No abrir hasta que el manómetro indique 0 de presión.
• Si queremos que el vapor salga más rápido y descienda la presión, podemos abrir la llave de desvaporización o de purga.

B. Tyndalización

Método de esterilización en el que la temperatura no sobrepasa los 60º y que consiste en realizar la operación durante 3 días consecutivos, consiguiendo que las esporas pasen a ser bacterias (formas vegetativas) en el 1º o 2º día y puedan ser destruidas en el 3º día. Cada uno de los 3 días se enciende durante 30 minutos el autoclave o un baño termostatizado a 60º manteniendo cerrado el aparato. Se emplea para esterilizar sustancias que pueden soportar altas temperaturas, pero siempre inferiores a 100º.

Por Calor Seco

Utiliza aire caliente seco y la operación de esterilización se lleva a cabo en horno o estufa Pasteur si la fuente de calor es de gas y estufa u horno Poupinel si es eléctrica. El horno Poupinel funciona de la siguiente manera:

• Introducir en él los materiales empaquetados, en cristal cerrado o en cajas metálicas, procurando dejar espacio entre ellos para que circule el aire correctamente y la temperatura se distribuya de forma homogénea.
• Conectarlo a la red eléctrica, encenderlo del interruptor y seleccionar la temperatura adecuada. Cuando el termómetro indique que se ha alcanzado dicha temperatura, se contabilizará el tiempo que debe durar el proceso de esterilización, y al finalizar se apaga el interruptor y se desenchufa.

• Ventajas: Facilidad de instalación y manejo y que permite esterilizar material metálico que con el calor húmedo se oxidaría. Al ser más penetrante que el calor húmedo, permite esterilizar material introducido en recipientes cerrados.
• Desventajas: Necesita altas temperaturas (entre 160-180ºC), por lo que los instrumentos pueden deteriorarse por el calor excesivo. No consigue una distribución homogénea de la temperatura. El calor seco destruye con una velocidad más lenta que el húmedo y requiere temperaturas más altas y tiempos de exposición más prolongados.

Por Filtración

Cuando los materiales son termolábiles, de modo que no pueden esterilizarse con calor ni mediante agentes físicos. A través de filtros es capaz de retener microorganismos, lo que se consigue por los filtros de tan pequeño tamaño de los poros del filtro y a la adsorción a las paredes del poro durante su paso a través del filtro, por la carga eléctrica de este y los microorganismos. Por este método de esterilización por filtración, los líquidos biológicos, soluciones de enzimas, algunas vitaminas y antibióticos que no soportan altas temperaturas ni radiaciones… Los filtros utilizados pueden ser:

• Filtros de membrana coloidal: Se trata de unos discos ésteres de celulosa con poros tan pequeños que impiden el paso de los microorganismos. Pueden ser desechables o recuperables por esterilización en autoclave y se usan para la esterilización de líquidos y el análisis microbiológico de aguas.
• Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air): Están compuestos por acetato de celulosa y se emplean para filtrar y esterilizar el aire, ya que logran retener partículas del aire que sale de una campana de flujo laminar.

Métodos Químicos

Por Óxido de Etileno

El óxido de etileno es un agente químico esterilizante tóxico para los microorganismos y volátil, lo que permite que sea fácilmente eliminado del objeto.

• Ventajas: Destruye todo tipo de bacterias, incluyendo esporas, virus y bacilos tuberculosos debido a su alto poder de penetración. Los objetos a esterilizar se empaquetan previamente en papel o recipientes abiertos. Se usa para material termolábil como plásticos, goma o equipos eléctricos.
• Inconvenientes: Es tóxico; si se inhala causa irritación en los ojos, náuseas, vómitos y trastornos neurológicos. Es un gas inflamable y de riesgo, por lo que su uso se debe llevar a cabo solo por personal cualificado y entrenado.

Precauciones:

• Evitar su inhalación y usar el equipo adecuado (mascarillas, gafas y guantes).
• Mantener una ventilación adecuada durante su manipulación.
• El material esterilizado precisa aireación durante un día o más antes de su uso.

Por Glutaraldehído al 2%

La solución acuosa de glutaraldehído al 2% es bactericida de amplio espectro y eficaz contra virus y esporas. Su mecanismo de acción afecta a las lipoproteínas de la membrana celular y el citoplasma de las formas bacterianas vegetativas, altera el sistema enzimático y el daño que hace en la membrana permite la salida de sustancias y componentes intracelulares, facilitando así la entrada directa del desinfectante en el citoplasma. El glutaraldehído al 2% es una solución acuosa estable que actúa a temperatura ambiente por inmersión del material hasta 24 horas, y sigue siendo activo ante la presencia de materia orgánica, aunque esta puede reducir la actividad. Viene en una solución tamponada con fenol, lo que hace de este producto uno de los más importantes esterilizantes. Previamente a su empleo, hay que proceder a activar la solución, lo que consiste en alcalinizar el producto hasta un pH de 7,5-8,5. Los preparados comerciales tienen una solución activadora, un inhibidor de corrosión y glutaraldehído al 2%, la cual se coloca en el momento de preparar el producto para ser usado por primera vez. Hay que tener la precaución de mezclar muy bien la preparación para evitar obtener una solución activada solo parcialmente.