Métodos de Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos en Sangre y Cultivos Celulares

Extracción de Ácidos Nucleicos de Muestras Biológicas

Sangre

La sangre es una de las muestras biológicas más habituales para estudiar los ácidos nucleicos de un individuo. Para este estudio, se suelen purificar los leucocitos, encargados de la defensa del organismo.

Consideraciones sobre la purificación de eritrocitos

¿Por qué no se purifican glóbulos rojos (eritrocitos)?

• No tienen material genético.
• El grupo hemo interfiere en técnicas de biología molecular (PCR).

Consideraciones sobre la obtención y conservación de la muestra

• Para la obtención de ácidos nucleicos en una muestra de sangre, lo ideal es partir de sangre total anticoagulada con EDTA. La heparina y el citrato sódico también se pueden usar.
• La extracción de los ácidos nucleicos es conveniente realizarla en las 24 horas siguientes a la obtención de la muestra. Si no se realiza, se puede conservar en refrigeración a 4 ºC durante 5 días.
• En cambio, si se van a aplicar técnicas que requieren moléculas de ADN intactas sin fragmentar, la sangre no puede almacenarse en nevera más de 3 días, ya que se degrada y se fragmenta.

Pretratamiento de la muestra de sangre

El pretratamiento más habitual en muestras de sangre consiste en:

1. Lisis de los hematíes (Hemólisis)

   Consiste en romper los eritrocitos mediante un choque osmótico o usando un detergente. (Nota sobre estados osmóticos: iso-normal, hiper-seco, hipo-hinchado).

2. Centrifugado de la muestra

   Se centrifuga la muestra y se obtiene un sedimento o pellet y un sobrenadante.

Cultivos Celulares

Los cultivos celulares son adecuados para realizar estudios genómicos y de expresión génica en determinadas condiciones y bajo ciertos estímulos.

Pretratamiento en Cultivos Celulares

El pretratamiento consiste en la recolección de las células antes de seguir con la extracción de los ácidos nucleicos. En cultivos celulares se dan principalmente dos situaciones:

Cultivos en suspensión

Las células se encuentran dispersas en el medio de cultivo. Si las células crecen en suspensión, se procede de la siguiente manera:

• Recolectar en un tubo.
• Eliminar el medio de cultivo mediante centrifugación.
• Lavar las células con tampón o suero fisiológico antes de iniciar la extracción y purificación de ADN o ARN.

Cultivos en monocapa

Las células crecen adheridas sobre un soporte sólido (plástico o vidrio). Existen dos posibilidades para el pretratamiento:

Opción A: Utilizar el propio frasco para la extracción

1. Retirar del frasco el medio de cultivo.
2. Lavar la monocapa con tampón o solución salina.
3. Iniciar in situ el procedimiento de extracción.

Opción B: Pasar la monocapa a un tubo

Para despegar la monocapa de células de la pared del frasco, se utilizan dos técnicas:

• De forma mecánica con raspador.
• Por métodos enzimáticos.

Tras retirar el medio de cultivo del frasco y lavar la monocapa con tampón o solución salina, se incuban las células con una solución de tripsina para despegar las células adheridas a la pared del frasco.

Pasos finales:

• Recolectar las células en un tubo.
• Lavar las células antes de continuar con la extracción.