Métodos de Laboratorio para Identificación de E. coli y Coliformes

Características de Escherichia coli (E. coli)

E. coli, familia Enterobacteriaceae, es un germen de forma bacilar, casi siempre móvil con flagelos perítricos, Gram negativo, posee estructura antigénica, es anaerobio facultativo, no forma esporas y es capaz de fermentar glucosa y lactosa.

Detección y Recuento de Coliformes

En Muestras Líquidas (NMP)

Sembrar a partir de las diluciones 1 ml en series de 3x3 de caldo BGBL (Verde Brillante Bilis Lactosa). Incubar a 31-24-48h. Lectura: presencia de gas en la campana y enturbiamiento. Realizar series para determinar el NMP (Número Más Probable).

En Muestras Sólidas (Recuento en Placa)

A partir de las diluciones decimales y por duplicado, añadir 1 ml de cada dilución a placas y luego verter 15 ml de agar VRBA (Violet Red Bile Agar). Mezclar y, una vez solidificado el medio, añadir otros 3-4 ml del mismo medio que forma una capa que impide el crecimiento excesivo, lo que facilita el recuento. Incubar a 31-24h. Lectura: contar colonias de color rojo púrpura rodeadas de una zona de precipitación de las sales biliares de color violeta. El recuento óptimo es entre 30 y 150 colonias por placa.

Identificación Confirmatoria de Escherichia coli

Para la identificación de E. coli a partir de cultivos positivos de coliformes:

• Subcultivar los cultivos positivos (+) en caldo BGBL con campana. Incubar a 43-24-48h. Lectura: Positivo (+) si hay gas en la campana.
• Sembrar en agar Levine (EMB - Eosin Methylene Blue Agar). Incubar a 43-24-48h. Lectura: Positivo (+) si hay colonias planas o ligeramente cóncavas con centros oscuros, casi negros, que ocupan las 3/4 partes de la colonia, y con luz reflejada presentan brillo metálico verdoso.
• Sembrar en agar AN (Agar Nutritivo) para purificar. Incubar a 37-24h. Positivo (+): rotura del medio y crecimiento en superficie.

Pruebas Bioquímicas para Identificación (IMViC y otras)

A partir de un cultivo puro en AN, realizar las siguientes pruebas:

Prueba de Indol

Sembrar colonias en tubos con medio TW (Triptófano). Incubar a baño maría durante 24h. Añadir reactivo de Kovacs. Reacción positiva (+): formación de un anillo rojo en la superficie. Negativa (-): anillo amarillento.

Prueba de Rojo de Metilo (RM) y Voges-Proskauer (VP)

Sembrar en dos tubos con medio Clark y Lubs. Incubar a 37°C durante 4 días.

• RM: Añadir dos gotas del reactivo RM. Positivo (+): coloración roja. Negativo (-): amarillo.
• VP: Añadir 0.6 ml de alfa-naftol y 0.2 ml de hidróxido potásico (KOH). Lectura en 15 min. Positivo (+): color rojo.

Prueba de Citrato

A partir de un cultivo reciente en AN, sembrar en agar Citrato de Simmons (solo en superficie). Incubar a 37-24h. Lectura: Negativo (-): sin cambios (verde). Positivo (+): azul.

Prueba de Kliger (TSI)

Sembrar por picadura en el fondo y en superficie en agar Kliger (TSI - Triple Sugar Iron Agar). Lectura:

• Fondo del tubo (fermentación de glucosa): Positivo (+): amarillo (ácido). Negativo (-): sin cambios.
• Zona inclinada (fermentación de lactosa): Positivo (+): amarillo. Negativo (-): rojo.