Métodos de Secuenciación de ADN y ARN: Técnicas y Procedimientos

Métodos de Secuenciación de ADN y ARN

Secuenciación: es el proceso de determinación de la secuencia de nucleótidos que componen una molécula de ADN o ARN y que se representa por las iniciales de las bases nitrogenadas que portan.

Molecula Monocatenaria

Se transcribe como una cadena de letras que inicia en el extremo 5' y extremo 3'.

Método Químico Maxam y Gilbert

Se basa en la modificación de las bases nitrogenadas mediante reacciones químicas específicas. Permite secuenciar fragmentos cortos de ADN y requiere cantidades elevadas de la molécula de ADN purificada.

Fases del Protocolo:

1. Marcaje de uno de los extremos de la molécula con el isótopo radiactivo 32P.
2. Reacciones de modificación química de las bases nitrogenadas:
   • Tubo 1: modificación de guaninas por dimetil sulfato.
   • Tubo 2: modificación de purinas (adenina y guanina) por ácido fórmico.
   • Tubo 3: modificación de pirimidinas (citosina y timina) por hidracina.
   • Tubo 4: modificación de citosinas con hidracina y sales.
3. Electroforesis en gel de poliacrilamida de alta resolución (10-20%).
4. Autorradiografía del gel.
5. Análisis de la autorradiografía.

Métodos Enzimáticos de Terminación de Cadena

Son métodos enzimáticos basados en reacciones de polimerización de cadenas complementarias a la que se quiere secuenciar. A la mezcla de reacción se añaden didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTP) que son desoxinucleótidos que carecen de grupo 3'OH, actúan como terminadores de cadena y detienen la síntesis.

Método Sanger

Para secuenciar fragmentos cortos de ADN monocatenario consta de 4 fases:

1. Reacciones de polimerización.
2. Electroforesis en gel.
3. Autorradiografía.
4. Análisis de los resultados.

Reacciones de Polimerización

La muestra se divide en 4 alícuotas para la realización de 4 reacciones de polimerización. Cada tubo contiene:

• Hebra molde de ADN (cadena que se quiere secuenciar).
• Cebador marcado en su extremo 5' con 32P y complementario del extremo 3' de la hebra molde.
• ADN polimerasa.
• Cuatro dNTP.
• Uno de los 4 ddNTP posibles.

Electroforesis

Las cadenas de nueva síntesis se preparan de las hebras molde mediante desnaturalización por calor y se someten a electroforesis de alta resolución en gel.

Autorradiografía del Gel

Proporciona en las cuatro calles del gel un patrón de bandas oscuras.

Análisis de Autorradiografía

El último nucleótido del fragmento que representa cada banda es el ddNTP. La lectura se realiza de abajo hacia arriba; los fragmentos más cortos migran más rápido que los largos. La secuencia que se lee directamente de la hebra molde será complementaria e irá en sentido contrario a la leída.

Variaciones del Método Sanger

Están relacionadas con la manera de marcar los fragmentos sintetizados en las reacciones de polimerización. Se puede utilizar:

• dNTP marcados.
• dNTP marcados radiactivos con 32P.
• dNTP fluorescentes.

Secuenciación de ARN

Se puede realizar directamente por métodos enzimáticos o indirectamente, previo paso a ADNc.

Los Métodos Enzimáticos Directos de Secuenciación de ARN

Son métodos de terminación de cadena, igual que el Sanger, para secuenciar ADN.

Los Métodos Indirectos de Secuenciación de ARN

Se basan en la obtención previa de un ADNc mediante transcripción inversa.

ADNc

Es luego secuenciado por cualquiera de los métodos de secuenciación de ADN y la secuencia obtenida se traduce a ARN, teniendo en cuenta la complementariedad de bases.