Precipitación salina y cromatografía de intercambio iónico para purificar ADN
Resumen
El texto explica la precipitación con sales (salting-out), que separa proteínas del lisado celular, y el posterior aislamiento del ADN mediante isopropanol y lavado con etanol. También describe los fundamentos de la cromatografía, sus elementos básicos y la cromatografía de intercambio iónico aplicada a la purificación de ácidos nucleicos.
Puntos clave
- La precipitación con sales (salting-out) separa proteínas mediante altas concentraciones salinas que provocan su agregación y sedimentación.
- Tras centrifugar, los ácidos nucleicos, las sales y los componentes hidrosolubles quedan en el sobrenadante.
- El ADN se precipita añadiendo un volumen igual de isopropanol al sobrenadante y centrifugando.
- El ADN precipitado se lava con etanol al 70-95% y se resuspende en agua Milli-Q o tampón TE.
- La cromatografía separa los componentes de una mezcla mediante una fase móvil que arrastra la muestra y una fase estacionaria que la retiene.
- En el intercambio iónico, un intercambiador aniónico con carga positiva retiene los ácidos nucleicos, que tienen carga negativa.
- Las proteínas y contaminantes con carga positiva no se unen al intercambiador y eluyen de la columna.
Precipitación con Sales (Salting-Out)
Fundamento Químico
La precipitación con sales, conocida como salting-out, se basa en la precipitación de proteínas en presencia de altas concentraciones salinas.
Las elevadas concentraciones salinas provocan que las proteínas formen agregados entre ellas y, consecuentemente, se precipiten.
Procedimiento de Separación
I. Precipitación de Proteínas
Se mezcla el lisado con una solución salina concentrada y se centrifuga, lo que resulta en la sedimentación de proteínas.
En el sobrenadante permanecen los ácidos nucleicos, sales y componentes hidrosolubles del lisado.
II. Precipitación de ADN
El sobrenadante del paso anterior se transfiere a un tubo limpio. Se añade un volumen igual de isopropanol y se vuelve a centrifugar, obteniendo el precipitado de ADN.
III. Lavado y Resuspensión del ADN
Se elimina el sobrenadante y el ADN se lava con etanol al 70-95%. Finalmente, se resuspende en agua destilada Milli-Q o en tampón TE, similar al método anterior.
Cromatografía
La cromatografía es un método físico de separación que permite la separación de los componentes (líquidos o gases) de una mezcla compleja.
Elementos Fundamentales de la Cromatografía
- Muestra o Analito: El componente de interés a separar.
- Fase Móvil: La fase que se mueve en una dirección definida y que transporta la muestra.
- Fase Estacionaria: Sustancia fija por la que se mueve la fase móvil, y que es responsable de la separación de los componentes de la muestra.
1. Cromatografía de Intercambio Iónico
Fundamento
Se basa en la unión electrostática reversible de iones en solución a grupos funcionales cargados que están unidos covalentemente a una fase estacionaria.
- Si los grupos funcionales de la fase estacionaria tienen carga positiva (+), se unen iones negativos (aniones).
- Si los grupos funcionales tienen carga neta negativa (-), se unen iones positivos (cationes).
Para la purificación de ácidos nucleicos (los cuales poseen carga negativa), se utiliza típicamente un intercambiador aniónico (que posee cargas positivas en la fase estacionaria).
Los grupos funcionales más utilizados en estos intercambiadores son el metilaminoetanol (MAE) y el dietilaminoetil (DEAE). En la cromatografía de intercambio iónico, la unión entre el intercambiador fijado en la fase estacionaria y la molécula de interés es reversible.
Esta unión dependerá del tipo de molécula que sea, de la concentración salina y del pH del medio.
Procedimiento Inicial
La columna de cromatografía se carga con la muestra, diluida en un tampón de baja salinidad.
En estas condiciones:
- Los ácidos nucleicos, al tener carga neta negativa (-), se unen a los grupos funcionales del intercambiador (que tienen carga +).
- Las proteínas, los polisacáridos y otros contaminantes del lisado con carga positiva (+) no se unen al intercambiador y eluyen de la columna.
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PDF Word HTMLPreguntas frecuentes
¿Qué es la precipitación con sales o salting-out?
Es un método que precipita proteínas en presencia de altas concentraciones salinas. Las sales provocan que las proteínas formen agregados entre ellas y se precipiten.
¿Qué grupos funcionales se usan en un intercambiador aniónico para ácidos nucleicos?
Se usan típicamente el metilaminoetanol (MAE) y el dietilaminoetil (DEAE). Ambos tienen carga positiva en la fase estacionaria y unen los ácidos nucleicos, que son negativos.
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