Mfn2: Regulador Clave del Estrés del Retículo y la Función Mitocondrial Mediante la Represión de PERK

Resumen

La inducción de estrés del retículo en células deficientes de Mfn2 causa una expansión masiva del retículo y una activación excesiva de las tres ramas de la UPR: PERK, XBP-1 y ATF6. El silenciamiento de PERK aumenta la apoptosis en células deficientes de Mfn2 como respuesta al estrés del retículo. En resumen, nuestros datos indican que Mfn2 es un elemento río arriba de PERK. Además, la pérdida de función de Mfn2 revela que PERK es un regulador clave en la morfología y función mitocondrial.

Introducción

El estrés del retículo ocurre cuando hay cambios en el balance redox, plegado anormal de proteínas y pérdida de calcio. Ante esta situación, actúan al menos tres proteínas de membrana del retículo: PERK, IRE1α y ATF6. Estas vías activan diversos factores de transcripción involucrados en la supervivencia celular durante las etapas tempranas del estrés del retículo y durante la apoptosis. La vía de PERK participa en la reducción de la síntesis de proteínas, la activación de la autofagia y la apoptosis, así como en la expresión de chaperonas. Aquí demostramos que Mfn2 es un nuevo regulador de PERK, y que este es requerido para la activación normal de la apoptosis y la autofagia durante el estrés del retículo. Además, la deficiencia de Mfn2 causa disfunción mitocondrial debido a una activación sostenida de PERK.

Conclusión a priori: Mfn2 inhibe o reprime a PERK (dado que, en ausencia de Mfn2, PERK se encuentra activo).

Resultados

Expansión Masiva del Retículo en Células Mfn2 KO Bajo Estrés

Las células Mfn2 KO (deficientes de Mfn2) muestran una expansión masiva del retículo en respuesta al estrés.

• Línea celular: MEF.
• Se utilizó tapsigargina (Tg) para inducir el estrés del retículo. Las células Mfn2 KO mostraron una expansión dramática del retículo, caracterizada por estructuras multilamelares (láminas apiladas), observadas mediante microscopía electrónica (Figura 1A-B).
• Se marcó Sec61 con GFP y se compararon las células mutantes Mfn1 KO, Mfn2 KO y WT. Solo en las células Mfn2 KO se observó expansión del retículo al estimular con Tg.
• Al reexpresar Mfn2 en las células Mfn2 KO, se observó un rescate del fenotipo normal mediante microscopía confocal de fluorescencia.
• Por último, se etiquetó el retículo y el Golgi con BFA y se analizó este marcador fluorescente mediante citometría de flujo. En el histograma se observaron dos poblaciones y, además, se analizó la fluorescencia emitida.

Disminución de la Apoptosis en Células Mfn2 KO en Respuesta al Estrés

Las células Mfn2 KO muestran una disminución de la apoptosis en respuesta al estrés.

• Líneas celulares: MEF, C2C12, 3T2-L1.
• Se utilizó tunicamicina como inductor de estrés del retículo.
• Se analizó la activación de la caspasa 3 mediante Western Blot (WB) y por citometría (SubG1 DNA). Se observó que en las células Mfn2 KO disminuyó la activación de la caspasa 3 (y, por ende, la apoptosis), mientras que en las células WT fue normal.
• Para comparar, se utilizó estaurosporina y cicloheximida (CHX) para inducir apoptosis de forma independiente al estrés del retículo, y se observó una activación normal de la caspasa 3.

Conclusión: En ausencia de Mfn2, no hay activación de caspasa 3 durante el estrés del retículo.