Optimización de la precisión y corrección en la medición de la expresión génica y proteómica

Precisión y Corrección en la Medición de la Expresión Génica y Proteómica

Precisión

Mejoras en el hardware: robots de impresión de chips, sensores, etc.
Mejoras a nivel computacional: selección de oligos, análisis de imágenes, determinación y tratamiento del background, compensación por no-linealidad de las señales que se miden, etc.

Corrección

Íntimamente relacionado con la interpretación de los datos: ¿cómo traducir intensidades en niveles de mRNA dentro de la célula?
Se aplica por igual a microarrays, Northern blots, cuantitative PCR (qPCR).
Multiplicación de ruido (error) que lleva a inconsistencias sistemáticas.

Total RNA

Supone que en cada punto del ensayo las células tienen el mismo contenido de RNA total. La misma cantidad de RNA total en cada experimento aseguraría que se utilizó el mismo número de células en cada uno.

Housekeeping

Asume que la expresión de ciertos genes constitutivos (housekeeping) no es regulada significativamente (esto es lo que la biología molecular viene utilizando para normalizar Northern Blots, RT-PCRs, etc).

Factores que Afectan los Valores Medidos

• Número de células en la muestra
• Eficiencia en el aislamiento del RNA
• Eficiencia RT-PCR / marcado
• Tamaño de spot y densidad
• Eficiencia de la hibridización/lavados
• Tiempo de exposición; sensibilidad en la detección

La Línea de Umbral

Es el nivel de detección o el punto en que una reacción alcanza una intensidad de fluorescencia por encima del fondo. La línea de umbral se fija en la fase exponencial de la amplificación de la lectura más exacta. El ciclo en el cual la muestra llega a este nivel se llama el ciclo umbral, CT. Estos dos valores son muy importantes para el análisis de datos utilizando el ensayo 5’ nucleasa.

Espectrometría de Masa en la Proteómica

• Medida de masas moleculares exactas.
• Identificación de proteínas por mapeo peptídico - High Throughput (alto rendimiento).
• Secuenciación de péptidos por base de datos o de novo.
• Determinación de modificaciones postraduccionales.
• Cuantificación diferencial de péptidos.

Proteómica

Estudia el conjunto de proteínas expresadas por una célula o un tejido en una determinada situación. Permite observar:

• Abundancia
• Dinámica
• Isoformas y modificaciones
• Estructura
• Complejos e interacciones
• Localización
• Perfiles clínicos