AMPLIFICACIÓN FINAL. Terminados los ciclos, la temperatura de elongación se mantiene por 5 min., lo que permite que la polimerasa termine la extensión de los productos a los cuales se encuentra unida. Temperatura 72-75º.

ALMACENAMIENTO TEMPORAL.

Durante la programación de los ciclos, se programa un ciclo final de 4º por varias horas, lo que permite conservar los productos de PCR hasta que se retiren los tubos de reacción del equipo.

Termociclador.

Equipo en el cual se realiza la PCR. Facilita la automatización del proceso de PCR. Permite calentar y enfriar tubos de reacción rápidamente y de forma exacta y precisa para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de reacción. Normalmente los rangos de temperatura van de 4-96º.

Los equipos cuentan con una placa metálica a manera de tapa, la cual se mantiene a 103º para evitar la evaporación de la mezcla de reacción durante la desnaturalización.

Para el enfriamiento cuenta con flujos de aire frío.

Todos los aparatos llevan un microprocesador para programar las etapas de cada ciclo con sus temperaturas y duración.

Visualización de la PCR convencional.

Por electroforesis en geles de agarosa o de acrilamida. La electroforesis permite separar fragmentos de acuerdo a su tamaño. Los fragmentos de ADN (cargados negativamente) se desplazan por el gel a través de un campo eléctrico hacia el polo positivo. Los más pequeños migran más rápido y son los que vemos más abajo. El producto amplificado se visualiza como una banda.

EVITAR LA CONTAMINACIÓN

Un punto clave en PCR es la minimización de la posibilidad de contaminación. Las posibles fuentes de contaminación son muestras biológicas, ácidos nucleicos usados como molde en PCR así como los amplicones (producto de PCR).

Lo ideal es trabajar en tres áreas diferentes separadas físicamente, y a las cuales se debe acceder siguiendo un camino en el cual una vez llegada a la última área no es posible llegar a atrás (flujo uni-direccional), con materiales de trabajo independientes en las distintas áreas:

Preparación de las muestras o área pre-PCR.

Con su juego de pipetas y zona UV para descontaminación, para la realización de mezclas de reacción. Lo ideal es que cuenta con un sistema de presión positiva.

Montar PCR o PCR-setup.

Aquí se agregará a los tubos preparados en el área 1, tubo a tubo el ADN molde. Siempre incluir un tubo blanco de reacción que debe tener todos los componentes de la mezcla excepto el molde, que se sustituye con agua. Se pueden hacer dos blancos, uno que se cierra en el área pre-PCR, que permite detectar si hay contaminación de reactivos, y otro que se deja abierto para asegurar que no hubo contaminación durante la manipulación. En el caso de contar con un control positivo, incorporarlo en cada tanda de reacciones. Recomendable que esta área tenga presión negativa.

Amplificación + análisis del producto de PCR.

Se pasa al termociclador y a la visualización de fragmentos amplificados. Conocida como área post-PCR. Recomendable que tenga presión negativa.

PCR MÚLTIPLE O MULTIPLEX PCR

Variante de la PCR. Es una PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en la misma reacción. Emplea dos o más pares de cebadores en un único tubo con el fin de amplificar simultáneamente diferentes fragmentos de ADN.

Ahorra tiempo y reactivos. Pero presenta un inconveniente, el diseño de los cebadores debe ser adecuado para permitir la detección de cada diana y no inhibir a las demás.