PCR Cuantitativa en Tiempo Real (qPCR): Fundamentos y Detección de Ácidos Nucleicos

PCR Cuantitativa en Tiempo Real (qPCR): Fundamentos y Aplicaciones

La PCR a tiempo real, también conocida como qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction), es una variación avanzada de la Reacción en Cadena de la Polimerasa utilizada para la cuantificación precisa de ADN o ARN mensajero (ARNm) en una muestra. Esta técnica permite determinar el número de copias absolutas o la cantidad relativa de una secuencia específica de ADN o ARN.

Principios de la qPCR

En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea, eliminando la necesidad de pasos adicionales post-amplificación. Además, mediante la detección por fluorescencia, es posible medir, durante la amplificación, la cantidad de ADN sintetizado en cada momento. Esto se debe a que la emisión de fluorescencia producida es directamente proporcional a la cantidad de ADN formado, lo que permite evaluar y registrar continuamente la cinética de la reacción de amplificación.

La cuantificación se realiza midiendo la cantidad de amplicón en cada ciclo de PCR. Esto se logra mediante la adición de fluoróforos que se unen de forma cuantitativa al ADN: a mayor producto, mayor fluorescencia. Los sistemas de PCR a tiempo real detectan la cantidad de fluorescencia en cada ciclo, y el software asociado representa dicha fluorescencia gráficamente. La cantidad de amplicón producido es directamente proporcional al número de moléculas de ADN/ARN iniciales en la muestra.

Fases de la Reacción de PCR

La reacción de PCR puede dividirse en cuatro fases distintas:

• Crecimiento Lineal: Fase inicial donde la amplificación es lenta y la señal de fluorescencia aún no es detectable por encima del ruido de fondo.
• Exponencial Temprana: Fase donde la amplificación comienza a ser eficiente y la señal de fluorescencia empieza a ser detectable.
• Exponencial: Fase óptima de la reacción, donde la amplificación es altamente eficiente y la cantidad de producto se duplica en cada ciclo.
• Finalización (o Plateau): Fase en la que la reacción se ralentiza y finalmente se detiene debido al agotamiento de reactivos o la inactivación de la polimerasa.

La fluorescencia evaluada para la cuantificación es la que se produce durante la fase de crecimiento exponencial temprana. El ciclo de PCR en el que la señal de fluorescencia supera un umbral predefinido (por encima del ruido de fondo) es denominado Ct (Cycle threshold) o CP (Crossing Point). Este valor está inversamente relacionado con el número de copias diana iniciales que posee la muestra, lo que posibilita una cuantificación con alta sensibilidad y especificidad.

Para llevar a cabo la qPCR, los termocicladores modernos incorporan un lector de fluorescencia que, simultáneamente a la reacción, indica en la pantalla la fluorescencia emitida por cada muestra. Esto permite determinar el momento exacto en el que comienza la amplificación para cada reacción.

Tipos de Fluoróforos en qPCR

Existen dos clases principales de fluoróforos utilizados en qPCR: genéricos y específicos.

Fluoróforos Específicos (Sondas Marcadas)

Las técnicas que emplean marcadores de fluorescencia específicos utilizan sondas de ácidos nucleicos marcadas con fluorocromos. Estas sondas se diseñan para unirse a amplicones específicos. Su principal ventaja radica en su alta precisión, ya que evitan la detección de posibles artefactos o secuencias inespecíficas que puedan estar presentes en el producto de la PCR.

Fluoróforos Genéricos (Colorantes Intercalantes)

La detección genérica se basa en la utilización de colorantes que se unen a todas las secuencias de ADN de doble cadena (agentes intercalantes). Una vez que el colorante se une al ácido nucleico, emite una señal fluorescente que se procesa en tiempo real. Un aumento en la cantidad de producto de PCR conduce a un aumento de la fluorescencia en cada ciclo, lo que permite cuantificar las concentraciones de ADN o ADNc (ADN complementario).

SYBR Green

El SYBR Green es un ejemplo prominente de agente intercalante. Es un compuesto que se une inespecíficamente al ADN de doble cadena, produciendo fluorescencia. Se inserta entre las bases del ADN, interrumpiendo la alineación y el emparejamiento de bases. Es importante destacar que los colorantes intercalantes como SYBR Green no son específicos, ya que se unen a cualquier molécula de ADN de doble cadena, incluyendo dímeros de cebadores o productos de amplificación inespecíficos.

El SYBR Green se une al surco menor del ADN de doble cadena. La emisión de fluorescencia se produce al unirse al ADN de cadena doble; cuanta mayor cantidad de producto genere la reacción, mayor será la fluorescencia emitida. Por lo tanto, cuantos más amplicones de doble cadena se formen, la señal producida por el colorante se incrementará.

Desventaja: Al unirse a todo tipo de ADN de doble cadena, los colorantes intercalantes como SYBR Green pueden generar falsos positivos en la identificación de un gen o segmento específico de ADN, ya que detectarán cualquier ADN de doble cadena presente.