Fases de la hibridación in situ: preparación, hibridación, lavado y detección

Preparación y fases de la hibridación in situ

I. Preparación de la muestra y soporte (prehibridación)

I. Preparación de la muestra y soporte (prehibridación). Es la fase de preparación de las muestras y del soporte. Se pueden desarrollar en múltiples pasos, incluyendo las digestiones enzimáticas y electroforesis.

II. Hibridación

2. Hibridación. Se produce la formación del híbrido sonda/secuencia diana, y es importante tener en cuenta varios factores:

• Tm del híbrido. La mayor eficiencia se consigue a Tm menos 25 °C (Tm - 25 °C).
• Se suele realizar a temperaturas prefijadas estándar, entre 37–42 °C, procurando que se realice en condiciones relajadas para facilitar la formación y la estabilidad del híbrido. Esto implica alta concentración de cationes monovalentes y baja concentración de formamida.
• Cuando se utilizan sondas de gran tamaño, en estas condiciones, además de los híbridos perfectos se van a formar también híbridos imperfectos con secuencias parecidas a la secuencia diana.
• El tiempo durante el que se incuba la sonda va a depender de la concentración de la sonda; según la técnica, puede oscilar entre 30 minutos y 24 horas.

III. Lavado de poshibridación

3. Lavado de poshibridación. El objetivo es mantener los híbridos sonda/secuencia diana y eliminar los híbridos imperfectos con secuencias parecidas a la diana. Esta fase depende en gran medida de la especificidad de la técnica.

El lavado se realiza con un tampón en el que se fijan las llamadas condiciones de rigurosidad de la técnica, combinando temperatura de lavado, fuerza iónica y concentración de formamida.

• En condiciones de rigurosidad relajadas: alta concentración salina y baja concentración de formamida.
• Lo habitual, en condiciones de rigurosidad elevada, permitiendo que se mantengan estables solo híbridos con bajo o ningún porcentaje de mismatch, se consigue de dos maneras: elevando la temperatura del lavado y usando un tampón de baja concentración salina y alta concentración de formamida.

IV. Fase de detección del híbrido

4. Fase de detección del híbrido. Consiste en detectar los híbridos específicos gracias al marcaje de la sonda. Entre los métodos de marcaje se incluyen:

• Marcaje radiactivo: sobre soporte; se realiza mediante autoradiografía.
• Fluorocromos: marcaje in situ y visualización mediante microscopio de fluorescencia.
• Haptenos: todo tipo de técnicas por métodos inmunohistoquímicos, con un antihapteno marcado con fluorocromo o con una enzima que cataliza la reacción.

Notas finales

Cada una de estas fases —prehibridación, hibridación, lavado y detección— debe optimizarse según la sonda, el tipo de muestra y el objetivo experimental. La combinación de temperatura, fuerza iónica y formamida determina la rigurosidad del proceso y, por tanto, la especificidad y sensibilidad del ensayo.