Pretratamiento de muestras de sangre para la extracción de ácidos nucleicos

Pretratamiento de muestras de sangre

En muchas ocasiones se requiere un pretratamiento de la muestra que se va a analizar; esto permitirá obtener las suspensiones celulares sobre las que se realiza la extracción y purificación de los ácidos nucleicos (Ac.N.).

La sangre es una de las muestras más habituales y está compuesta por plaquetas, leucocitos y eritrocitos. Uno de los pretratamientos más frecuentes de la sangre es la lisis de hematíes.

Pasos para la lisis de hematíes

1. Lisis de hematíes: Consiste en romper los hematíes utilizando un tampón de lisis.
2. Centrifugado de la muestra: Tras este paso se obtendrá, en el tubo centrifugado, un sedimento y un sobrenadante.
3. Eliminación del sobrenadante: Con esto eliminamos el plasma y la hemoglobina.
4. Conservación del sedimento: Donde se encuentran los leucocitos.

Obtención de PBMC (Linfocitos y Monocitos)

Para la obtención de PBMC se realiza una centrifugación en gradiente de densidad siguiendo estos pasos:

1. Preparación del tubo: Se utiliza un tubo con medio de separación y se coloca la sangre encima.
2. Centrifugar: Durante 20-30 minutos a 400-800 g, según el medio. La polisucrosa es el componente del medio que sedimenta los hematíes. Los leucocitos sedimentan por su propia densidad; las células mononucleares tienen una densidad mayor que el medio y menor que el plasma, por lo que se quedan situadas entre ellos.
3. Eliminar plasma: Se debe retirar el plasma y pasar las PBMC a un tubo limpio para lavar con tampón o solución salina.
4. Células lavadas: Continuar con el proceso correspondiente.

Extracción de Ácidos Nucleicos (Ac.N.)

En el proceso de extracción se realizan dos procesos fundamentales:

• Lisis celular: Para liberar los ácidos nucleicos de las estructuras celulares.
• Inactivación de nucleasas celulares: Para evitar la degradación de los ácidos nucleicos.

Soluciones de lisis y reactivos

Se utiliza una u otra solución según la célula a lisar:

• Detergentes: Destruyen la bicapa lipídica de la membrana y desnaturalizan proteínas (utilizados en muestras humanas y animales).
• EDTA: Quelante de cationes divalentes (Ca y Mg). El Mg es un cofactor de las ADNasas; el EDTA capta los cationes y así inhibe la actividad de las ADNasas.
• Proteasas: Facilitan la rotura y disolución de las proteínas de la membrana y eliminan nucleasas (especialmente en muestras de tejidos frescos).
• Agentes caotrópicos: Inactivan las nucleasas ya que desnaturalizan las macromoléculas, impidiendo que realicen su actividad biológica.