Principios Esenciales de Microbiología Clínica: Detección, Cultivo y Pruebas de Susceptibilidad

Objetivos del Laboratorio de Microbiología Clínica

Los objetivos principales del laboratorio de microbiología clínica son:

• Identificar el género y la especie del microorganismo causante de la enfermedad infecciosa, y realizar las pruebas necesarias para su obtención.
• Establecer la terapia adecuada, pronosticar la evolución de la enfermedad y estudiar la epidemiología del proceso infeccioso.

Agentes Biológicos

Los microorganismos (MO), incluyendo los genéticamente modificados, cultivos celulares y endoparásitos humanos, son susceptibles de originar cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad.

Se clasifican según su peligrosidad en diferentes grupos:

• Grupo 1: Agente biológico poco probable que cause enfermedad en el hombre (ejemplo: Lactobacillus).
• Grupo 2: Puede causar enfermedad en el hombre, con peligro para los trabajadores, pero poco probable que se propague. Existe tratamiento y profilaxis eficaces (ejemplos: Salmonella spp., Virus de Epstein-Barr).
• Grupo 3: Causa enfermedad grave en el hombre y representa un peligro para la salud de los trabajadores. Existe tratamiento y profilaxis adecuada (ejemplo: Mycobacterium tuberculosis).
• Grupo 4: Causa enfermedad grave en el hombre y representa un peligro grave para los trabajadores. Se propaga fácilmente y no existe tratamiento ni profilaxis adecuada (ejemplo: Virus del Ébola).

Diagnóstico Microbiológico de Enfermedades Infecciosas

La identificación del agente patógeno se puede realizar de dos formas:

• Directa: Identificación del microorganismo mediante cultivo y aislamiento, identificación de productos microbianos específicos como antígenos (AG), toxinas, o secuencias específicas de genes.
• Indirecta: Detección de anticuerpos (AC) específicos frente a determinados microorganismos. La muestra utilizada es sangre.

El primer método (directo) es clásico, mientras que los otros dos (detección de productos o genes, e indirecto) son rápidos.

Tinciones en Microbiología

Las tinciones son técnicas fundamentales para la visualización y clasificación de microorganismos:

• Simple: Utiliza un solo colorante y permite diferenciar algunas morfologías.
• Diferencial: Permite diferenciar entre distintos tipos de microorganismos atendiendo al tipo de pared celular que poseen. Utiliza dos colorantes y un agente decolorante, y un segundo colorante o de contraste. Con estas tinciones, podemos teñir esporas y flagelos.

Ejemplos de tinciones diferenciales:

• Tinción de Gram: Diferencia bacterias según la estructura de su pared celular.
  • Gram positivas (+): Se tiñen de violeta.
  • Gram negativas (-): Se tiñen de rosa.
• Tinción Ácido-Alcohol Resistente (Ziehl-Neelsen): Basada en las características de la pared celular, diferencia micobacterias y se utiliza para diagnosticar tuberculosis y lepra.
• Tinción de Giemsa: Diferencial, utilizada para rickettsias.

Normas de Recogida y Transporte de Muestras para Análisis Microbiológico

Para asegurar la fiabilidad de los resultados, es crucial seguir estas normas:

• La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso y siempre del lugar anatómico correcto.
• Recoger en momentos óptimos (ejemplo: orina de primera hora, sangre cuando hay pico febril).
• Las muestras deben ser recogidas en cantidad suficiente y con una técnica adecuada para evitar que los microorganismos se inactiven o pierdan viabilidad.
• Si es posible, la recogida debe realizarse antes del tratamiento con antibióticos.
• Se recogerá y transportará en un recipiente adecuado y estéril.
• El recipiente debe estar rotulado y acompañado del volante de petición.
• El volante debe incluir información relevante como la fecha de comienzo de la enfermedad, tratamiento antibiótico actual, sexo, edad, etc.
• El transporte al laboratorio debe ser rápido y, en caso contrario, la muestra se almacenará correctamente.

Criterios de Rechazo de Muestras

Una muestra puede ser rechazada si presenta alguna de las siguientes condiciones:

• Identificación deficiente o ausencia de identificación.
• Transporte o conservación prolongada o inapropiada.
• Muestras derramadas, insuficientes o inadecuadas.

Sensibilidad y Especificidad en Pruebas Diagnósticas

• Sensibilidad: Se refiere a la concentración más baja de antígeno (AG) que puede ser detectada por una prueba.
• Especificidad: Es la habilidad del anticuerpo (AC) de reconocer a un único antígeno.

Cuando un antibiótico es capaz de inhibir el crecimiento de microorganismos, a mayor cantidad de antibiótico, mayor será la inhibición. Existirá una determinada concentración de antibiótico que inhibirá totalmente el crecimiento del microorganismo.

Medios de Cultivo en Microbiología

Los medios de cultivo son soportes sintéticos que contienen nutrientes y que permiten el crecimiento de microorganismos.

Clasificación de Medios de Cultivo

Según su Composición:

• Medios Definidos: Se conoce perfectamente y con exactitud los componentes y su composición.
• Medios Complejos: Se sabe qué contienen, pero no la composición exacta del medio. Son muy ricos en nutrientes y útiles para que crezcan diversos microorganismos.

Según su Estado Físico:

• Medios Sólidos: Si al medio se le añade agar, le da consistencia para aislar colonias (ejemplo: medio sólido con 2% de agar).
• Medios Semisólidos: Contienen aproximadamente 0.5% de agar.

Según su Función:

• Medios Generales: Suelen tener muchos nutrientes y son la primera elección cuando se tiene una muestra clínica. Son la base de un medio general (ejemplos: Agar Sangre, Agar Chocolate, Agar Schaedler).
• Medios Selectivos: Medio de cultivo al cual se le añade algo para permitir el crecimiento de unos microorganismos e inhibir el de otros (ejemplos de aditivos: antibióticos, pH, colorantes). Ejemplos: Thayer-Martin, Löwenstein-Jensen.
• Medios Diferenciales: Nos permiten diferenciar diferentes tipos de microorganismos. Crecen todos los microorganismos, pero con diferente color o características, atendiendo a sus propiedades metabólicas. Ejemplos: CLED (Lactosa +/-), EMB, Agar McConkey.
• Medios Selectivos-Diferenciales: Permiten el crecimiento de un microorganismo e inhiben el de otro, y el que crece se puede diferenciar según sus características. Ejemplos: McConkey, EMB, Hektoen, Salmonella-Shigella, Bismuto-Sulfito.

Ejemplo de Medio Selectivo-Diferencial: Agar McConkey

El Agar McConkey es un medio selectivo para enterobacterias (bacilos Gram negativos) y diferencial para las bacterias que fermentan lactosa. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el crecimiento de Gram positivos y algunos Gram negativos. La lactosa que contiene el medio, si es fermentada por la acción de las bacterias, producirá ácidos que reaccionarán con las sales biliares, dando un precipitado de color rojo-rosado. Por lo tanto, podríamos decir que es un medio selectivo-diferencial. Ejemplos de bacterias que pueden crecer en este medio: Proteus, Shigella, Salmonella.

Morfologías y Agrupaciones Bacterianas Comunes

Las agrupaciones se hacen en función del plano de división de la bacteria.

• Cocos:
  • Diplococo
  • Estreptococo
  • Sarcina
  • Estafilococo
• Bacilos:
  • Cobacilo
  • Estreptobacilo
  • Diplobacilo
  • Bacilo único

Elección de Medio para Gram Negativos, Lactosa Positivos

Para bacterias Gram negativas y lactosa positivas, se pueden elegir medios como el Agar McConkey o el EMB (Eosina Azul de Metileno).

• En Agar McConkey, las sales biliares y el cristal violeta inhiben el crecimiento de Gram positivos. La lactosa, si es fermentada por la acción de las bacterias, producirá ácidos que reaccionarán con las sales biliares, dando un precipitado rojo-rosado.
• El EMB es también selectivo-diferencial. La eosina y el azul de metileno inhiben el crecimiento de Gram positivos y algunos Gram negativos. La fermentación de glucosa precipita ambos colorantes al acidificar. Ejemplos: E. coli, Salmonella.

Epsilon Test (Etest)

El Etest es un método para determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), siendo una alternativa a las técnicas de dilución. El antibiótico viene en tiras y se aplica en un soporte sólido con el microorganismo ya sembrado de manera radial. Se deja incubar un tiempo a una temperatura adecuada. Esta tira posee un gradiente de concentración; el punto donde el halo de inhibición corta la tira es la CMI.

Título de Anticuerpos y Evolución de la Enfermedad

El título de un anticuerpo es el inverso de la mayor dilución de un anticuerpo capaz de dar una reacción de aglutinación frente a un antígeno determinado. Como la concentración de antígeno es constante, hay un punto en el cual la dilución es tan grande que no se produce una reacción de aglutinación.

Cuanto mayor sea el título, significa que el paciente posee una mayor concentración de anticuerpos y se corresponde con la fase aguda de una enfermedad. A menor título de anticuerpos en el paciente, puede significar el fin de la infección o que se ha llegado a una fase crónica. Siempre se necesitan mínimo dos resultados de titulación para comprobar el cambio. Según varía el título de anticuerpos, podemos saber en qué fase de la enfermedad se está y proporciona información de cómo está evolucionando un paciente.

Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana: Técnicas de Difusión y Dilución

Antibiograma (Técnica de Difusión en Disco)

El antibiograma define la actividad in vitro de un antibiótico frente a un microorganismo, permitiéndonos comparar si el antibiótico es capaz de inhibir el crecimiento del microorganismo. Siempre se realiza in vitro, ya que se requiere un cultivo puro del microorganismo.

Se utiliza un soporte sólido (Agar Mueller-Hinton) para la siembra del microorganismo. Diferentes antibióticos en forma de disco (hechos de papel de filtro o tira) se colocan una vez sembrado el microorganismo. Se incuba un cierto tiempo a temperatura adecuada y se observa cómo se forman o no halos de inhibición alrededor de los discos a medida que difunde el antibiótico. Se determina si el antibiótico es efectivo midiendo el halo de inhibición; no por ser más grande es mejor antibiótico, hay que utilizar unas tablas estandarizadas para saber si el halo implica resistencia o sensibilidad al antibiótico.

Ventajas: Rápido y permite probar diferentes tipos de antibióticos simultáneamente.

Desventajas: No permite conocer la CMI ni la CMB. Se necesita saber interpretar los resultados según tablas.

Técnica de Dilución (en Caldo)

Se utiliza un soporte líquido para efectuar la siembra de microorganismos. Se utilizan diferentes tubos con la misma concentración de microorganismos y en cada tubo se añade una concentración creciente de un mismo antibiótico. El medio de cultivo común es el Mueller-Hinton.

Se incuban cierto tiempo a temperatura adecuada y se observa cómo cambia el crecimiento a medida que se añade más antibiótico. Se puede observar si el antibiótico es efectivo a medida que se deja de ver turbidez en el tubo, y se podrá decir que es efectivo cuando no haya turbidez, ya que significa que no ha crecido el microorganismo.

Esta técnica permite obtener la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), ya que se conoce la mínima concentración de antibiótico que se necesita para inhibir el crecimiento bacteriano al 100%. También permite conocer la Concentración Mínima Bactericida (CMB), que es la mínima concentración de antibiótico necesaria para reducir en un 99.99% el inóculo bacteriano inicial.

Desventajas: Es un método más laborioso y solo permite probar un tipo de antibiótico y microorganismo a la vez.