Principios y Factores Clave de la Electroforesis: Preparación y Migración Molecular

La Preparación y el Uso del Equipo

• Preparación de la muestra

  Se aplican otros medios de separación para conseguir **concentrar las sustancias**.

• Preparación del soporte

  Se debe preparar el gel, disponerlo en un molde y conseguir que tenga un **grosor y textura adecuados**.

• Preparación del tampón

  Cuando todo esto está listo, se siembra la muestra en el soporte.

Para la siembra de la muestra, es crucial considerar la carga de las moléculas:

• Si las moléculas tienen **carga positiva**, se colocan cerca del **ánodo**.
• Si las moléculas tienen **carga negativa**, se colocan cerca del **cátodo**.

Finalmente, se seleccionan los **parámetros eléctricos** y el **tiempo**. Cuando se pone en marcha, se crea una **diferencia de potencial** y las moléculas empezarán a migrar por el medio.

El resultado será una serie de **bandas** sobre el soporte, de las cuales cada una corresponderá a una sustancia.

Después se realiza un **revelado**, que consiste en poner de manifiesto las bandas en las que ha sido separada la muestra. Suele consistir en la adición de un **colorante** y el posterior lavado.

Tras el revelado, es necesario **interpretar la información** obtenida.

Factores que Afectan a la Velocidad de Migración

Forma y Tamaño de las Moléculas

Las de mayor tamaño tienen mayor **fricción** y, por tanto, **menor velocidad de migración**. Las que tienen **formas esféricas** migran a **mayor velocidad** que las que tienen formas irregulares.

Soporte

Su presencia hace que se produzcan tres fenómenos en la migración:

• Adsorción

  **Retención inespecífica** de las moléculas de la muestra sobre el soporte.

• Electroendósmosis

  Se da sobre todo en los **soportes no restrictivos**.

• Tamizado molecular

  Efecto debido al **diámetro de poro**.

Tampón

• Ayuda a paliar los efectos de la **electrólisis**.
• Mantiene una **fuerza iónica adecuada**. La fuerza iónica del tampón condiciona la **movilidad electroforética** de los componentes de la muestra. Tiene que ser suficiente para mantener el **pH** y la **conductividad**, pero no muy elevada porque interfiere en el sistema, disminuyendo la velocidad de migración.
• Mantiene una **carga neta constante**.

Campo Eléctrico

Se debe tener en cuenta el **efecto Joule**. El paso de la corriente eléctrica produce **calor**. Al aumentar la temperatura, las proteínas se **desnaturalizan** y el tampón se evapora, lo cual hace que aumente la **fuerza iónica**, y estos dos efectos se combinan para impedir una buena separación.

El efecto Joule es mayor cuanto mayor sea la **diferencia de potencial** y la **resistencia**; por lo tanto, las electroforesis de **alto voltaje** requieren un **sistema de refrigeración**.

Tiempo de Electroforesis

El tiempo se debe combinar con el **voltaje** y el **tamaño del soporte**.

Si se aumenta el tiempo, se incrementan las **distancias de separación** entre las moléculas que migran con distintas velocidades.