Principios Fundamentales de la Cromatografía: Fases, Tipos y Componentes Clave del Cromatograma

Fundamentos de la Cromatografía

La cromatografía es una técnica de separación que se basa en el diferente comportamiento de los componentes de la muestra al ser desplazados o retenidos por la acción conjunta y contrapuesta de una fase móvil que se hace pasar a través de una fase estacionaria.

• Los componentes más retenidos por la fase estacionaria se desplazan más lentamente con el flujo de la fase móvil.
• Las sustancias que componen la muestra se separan según su distinta movilidad.

Definiciones Clave

Fase Móvil (FM)

Fase que se mueve en una dirección definida, fluye a través de una fase estacionaria, arrastrando con ella a los compuestos de la mezcla.

Fase Estacionaria (FE)

Fase que está fija en una posición durante la cromatografía. A su través fluye la fase móvil arrastrando los analitos.

Analito

Es la sustancia que se va a separar durante el proceso cromatográfico.

Clasificación de la Cromatografía

Tipos según el Sistema de Soporte

La clasificación se basa en la forma en que se dispone la fase estacionaria:

• Cromatografía Plana:
  • En papel.
  • En capa fina (TLC).
• Cromatografía en Columna.

Cromatografía Plana

El soporte de la fase estacionaria es plano (papel o gel) sobre el que se desplaza la fase móvil por capilaridad o gravedad. Los cromatogramas planos consisten en bandas separadas que se revelan pulverizando la capa con fluoresceína o ninhidrina. Una vez identificadas, las bandas se recortan y cuantifican fotométricamente.

Cromatografía de Reparto en Papel

El agua retenida en las fibras de celulosa del papel actúa como fase estacionaria. La fase móvil es una mezcla de disolventes orgánicos acuosos.

Cromatografía en Capa Fina (TLC)

En la TLC, la fase estacionaria es líquida y está unida a un gel (como sílice o celulosa) que se extiende sobre un vidrio o plástico en forma de capa fina de diferentes espesores. La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes que asciende por capilaridad.

La relación entre las distancias recorridas por el soluto y por el disolvente desde el origen de la placa se conoce como Factor de Retardo (Rf), y tiene un valor constante para cada compuesto en unas condiciones cromatográficas determinadas.

Cromatografía en Columna

Se obtiene un cromatograma que consiste en una serie de picos que aparecen en función del tiempo y que se corresponden específicamente con la presencia de una molécula y su concentración en la muestra.

• Estos picos pueden ser detectados por espectrofotometría a medida que van saliendo por la columna.
• Los picos de la gráfica identifican las sustancias por comparación con los tiempos de retención.
• El área de los picos permite calcular la concentración de la sustancia.
• Cuanto más estrechos y separados estén los picos, mejor será la separación de las sustancias.

Componentes y Parámetros del Cromatograma

Tiempo Muerto (t_M)

Tiempo que tarda en salir la fase móvil desde que se inyecta la muestra.

Línea Base

Señal producida cuando solo pasa la fase móvil.

Altura y Área de Pico

Informa sobre la concentración de la sustancia. Es necesaria una calibración previa.

Tiempo de Retención (t_R)

Tiempo que tarda en salir una determinada molécula. Proporciona la identificación de un compuesto al ser comparado con un patrón de composición conocida.

Tiempo de Retención Corregido (t'_R)

Tiempo real que la fase estacionaria ha retrasado el avance del analito.

Mecanismos de Separación Cromatográfica

Cromatografía de Reparto

Separa las sustancias según su distribución en dos fases líquidas inmiscibles. Cada sustancia migra una distancia según su solubilidad y se define para cada sustancia un valor, el Factor de Retardo (Rf).

Modalidades de Reparto

• Cromatografía en Fase Normal: La fase móvil es apolar y la fase estacionaria es polar (retiene los componentes polares).
• Cromatografía en Fase Reversa: La fase móvil es polar y la fase estacionaria es apolar (retiene los componentes apolares).

Cromatografía de Intercambio Iónico

Las sustancias se separan según su carga. Se basa en la interacción iónica del soluto con la fase estacionaria, la cual tiene grupos funcionales cargados.

El mecanismo se fundamenta en la afinidad de iones en disolución por los contraiones presentes en la fase estacionaria (interacciones electrostáticas). Esto produce una competencia entre el analito y los iones de la fase móvil por su unión a los grupos iónicos de la fase estacionaria.