Principios Fundamentales de Espectrofotometría: Ley de Lambert-Beer y Curvas de Calibración

Fundamentos de Espectrofotometría

La espectrofotometría es un método analítico que utiliza los efectos de la interacción de las radiaciones electromagnéticas con la materia (átomos y moléculas) para medir la absorción o la transmisión de luz por las sustancias. En bioquímica, se utiliza fundamentalmente para:

• Identificar compuestos por su espectro de absorción.
• Determinar la concentración de un compuesto en una disolución.
• Seguir el curso de reacciones químicas y enzimáticas.

Principios de Absorción de Luz

Las sustancias químicas son capaces de absorber luz (o radiaciones electromagnéticas) de determinadas longitudes de onda. Esto ocurre cuando la energía de la radiación es igual a la diferencia de energía entre los estados fundamental y excitado de los átomos o moléculas que las componen.

Cuando un haz de luz monocromática (de una sola longitud de onda) incide sobre una disolución de una sustancia que la absorbe, la intensidad de la luz transmitida (la que atraviesa la disolución) es menor que la incidente. Por ejemplo, si una sustancia absorbe el 20% de la luz incidente, transmite el 80%.

Transmitancia y Absorbancia

Se define la Transmitancia (T) como la fracción de la luz incidente que es transmitida. Si I₀ es la intensidad de la luz incidente e I_t es la intensidad de la luz transmitida, entonces:

T = I_t / I₀

Por otro lado, la Absorbancia (A) o Densidad Óptica (D.O.) se define como el logaritmo en base 10 del inverso de la transmitancia:

A = log (1 / T) = -log T

Ley de Lambert-Beer

La absorbancia de una sustancia en disolución depende de varios factores:

• El espesor de la muestra (longitud del paso óptico).
• La concentración del compuesto absorbente.
• La naturaleza química de la sustancia.

Estos factores se expresan cuantitativamente mediante la Ley de Lambert-Beer:

A = ε · c · l

Donde:

• A es la Absorbancia.
• ε (épsilon) es el coeficiente de extinción molar (o absortividad molar), una constante que depende de la naturaleza de la sustancia, la longitud de onda y la temperatura.
• c es la concentración de la sustancia en la disolución.
• l es la longitud del paso óptico (espesor de la cubeta).

El Espectrofotómetro y su Calibración

La absorbancia y la transmitancia de una sustancia en disolución se miden con un equipo denominado espectrofotómetro.

Antes de realizar cualquier medida, es fundamental calibrar el espectrofotómetro. El procedimiento de ajuste o calibrado dependerá del modelo específico del equipo.

Es crucial tener en cuenta que la Ley de Lambert-Beer deja de ser lineal a altas concentraciones de la muestra. Por lo tanto, para asegurar la validez de las mediciones, es recomendable utilizar soluciones diluidas.

Curvas de Calibración en Espectrofotometría

La construcción de curvas de calibración es una aplicación fundamental de la espectrofotometría para la cuantificación de sustancias. Este proceso implica la determinación de la absorbancia de soluciones estándar (o patrón) de concentración conocida de una sustancia.

Al graficar la absorbancia frente a la concentración, se establece una relación lineal, lo cual es una ventaja significativa. Esta linealidad, que representa la Ley de Lambert-Beer en su rango válido, permite elaborar una curva de calibración precisa con solo cuatro o cinco puntos.

Una vez establecida la curva, se puede determinar la concentración desconocida de una muestra de la misma sustancia mediante la interpolación de su absorbancia en la curva de calibración.

El Coeficiente de Extinción Molar (ε)

El "factor de calibración" al que se refiere el texto corresponde al coeficiente de extinción molar (ε) en la ecuación de Lambert-Beer (A = ε · c · l).

El valor de ε es característico para una sustancia específica a una determinada longitud de onda y temperatura. Se determina experimentalmente relacionando las absorbancias medidas de las soluciones estándar con sus respectivas concentraciones.

Conociendo las absorbancias correspondientes a concentraciones conocidas, el coeficiente de extinción molar (ε) se puede calcular fácilmente y, teóricamente, es constante para todas las concentraciones de una misma sustancia dentro del rango de linealidad de la Ley de Lambert-Beer.