Procesos Esenciales de Separación y Purificación: De la Filtración a la Cromatografía

Procesos Esenciales de Separación y Purificación en Biotecnología

Filtración: Fundamentos y Variantes

Filtración de Superficie (o de Torta)

En la filtración de superficie, si el tamaño de la torta de filtración (capa de sólidos retenidos) es muy grande, esta queda saturada y ya no filtra eficazmente, aunque se aumente la presión de operación.

Filtración Tangencial (o de Flujo Cruzado)

En la filtración tangencial, el flujo del fluido es paralelo a la superficie del medio filtrante. A medida que las partículas (como los pigmentos) se adhieren a la membrana, el flujo tangencial las arrastra, minimizando la acumulación y la formación de una torta gruesa. Este es un sistema considerado autolimpiable y, característicamente, no se forma una torta de filtración significativa como en la filtración frontal.

Microfiltración Tangencial

La microfiltración opera con un principio similar al de la filtración tangencial, a menudo con mayores flujos o configuraciones específicas. Se utilizan filtros tangenciales, comúnmente de cerámica, con poros de tamaño adecuado (típicamente 0.1 a 10 µm) que retienen células y otras partículas grandes, permitiendo la salida del líquido (permeato). Estos sistemas son esterilizables y pueden operar de forma continua o discontinua. En una configuración común, el fluido a separar circula por el exterior de los elementos filtrantes (membranas), mientras que la presión se aplica desde el interior, o viceversa, forzando al permeato a pasar a través de la membrana.

Ultrafiltración

La ultrafiltración emplea membranas con un tamaño de poro muy pequeño (típicamente 0.001 a 0.1 µm), capaces de retener macromoléculas y virus. El permeato es la fracción del líquido que atraviesa la membrana, mientras que el retenido (o concentrado) es la fracción que no pasa y contiene las especies de mayor tamaño, quedando más concentrada.

Técnicas de Lisis Celular y Homogeneización

Homogeneizador a Presión

Un homogeneizador a presión consiste en una bomba de pistón de desplazamiento positivo que impulsa una suspensión celular a alta presión a través de una válvula de descarga ajustable con un orificio de restricción. La súbita caída de presión y las fuerzas de cizalla provocan la lisis celular.

Ultrasonidos

Los ultrasonidos son ondas sonoras de frecuencia superior a 15-20 kHz. Al aplicarse a un medio líquido, generan fenómenos de cavitación (formación y colapso de microburbujas) que pueden erosionar el material celular y, además, aumentar la temperatura local del medio.

Procesos de Agregación y Separación Gravitatoria

Floculación

Las células (por ejemplo, bacterias) suelen presentar cargas negativas en su superficie, lo que causa repulsión mutua y la formación de una disolución coloidal estable. En la floculación, se añade un electrolito (agente floculante) que neutraliza estas cargas superficiales, permitiendo que las partículas se agrupen y formen flóculos. Estos son agregados de mayor diámetro y densidad que pueden separarse posteriormente por filtración o sedimentación. Para inducir la floculación, se pueden realizar cambios de pH (que alteran la carga de las partículas) y/o añadir polielectrolitos (polímeros que ayudan a agregar las partículas, reduciendo la repulsión electrostática).

Sedimentación

La sedimentación puede utilizarse como un proceso de separación de biomasa (células, microorganismos) cuando estas tienden a agregarse (coagular) o a formar flóculos, ya sea de forma natural o inducida con la ayuda de cationes polivalentes o polímeros extracelulares. Las partículas más densas sedimentan por gravedad.

Métodos de Separación por Transferencia de Fase y Afinidad

Extracción Líquido-Líquido

La extracción es un proceso donde se ponen en contacto dos fases líquidas inmiscibles (que no se mezclan) con el objetivo de transferir uno o varios componentes (solutos) de una fase a otra, basándose en sus diferencias de solubilidad. Esto permite aislar o eliminar moléculas específicas del sistema original.

Adsorción

La adsorción es un fenómeno de superficie donde un soluto se adhiere a la superficie de un sólido. Se utiliza frecuentemente para eliminar sustancias no deseadas de una disolución. El material adsorbente más empleado es el carbón activo, debido a su alta porosidad y gran área superficial. El proceso de adsorción implica el reparto de un soluto entre la disolución (fase fluida) y la superficie del sólido adsorbente.

Usos de la Adsorción:

• Eliminar sustancias no deseadas (impurezas, colorantes, olores).
• Adsorber un producto de interés para aumentar su concentración una vez que es eluido (liberado) del medio de adsorción.

Precipitación

La precipitación es la formación de un sólido a partir de una disolución. Puede inducirse por varios métodos:

• Precipitación por reacción con un agente precipitante: Por ejemplo, la adición de un catión divalente (como Ca²⁺) a una disolución de un exopolisacárido para formar un precipitado insoluble.
• Precipitación por adición de un disolvente orgánico: Por ejemplo, la precipitación de dextrano (un polisacárido) utilizando acetona, que reduce su solubilidad en el medio acuoso.
• Precipitación por cambio de pH: Alterar el pH de la disolución puede cambiar la carga y la solubilidad de las moléculas (especialmente proteínas), llevándolas a precipitar en su punto isoeléctrico.

Cromatografía: Separación de Alta Resolución

La cromatografía es una técnica versátil para la separación de los componentes de una mezcla (disuelta en una fase móvil) basada en su retención diferenciada sobre un soporte sólido o fase estacionaria. Los componentes se separan debido a diferencias en su afinidad, tamaño, carga u otras propiedades.

Cromatografía de Elución

En la cromatografía de elución, se introduce un pulso de la muestra en la cabeza de la columna cromatográfica. El eluyente (fase móvil) fluye continuamente a través de la columna. Los diferentes constituyentes de la muestra se reparten entre la fase móvil y la estacionaria, y se desplazan a diferentes velocidades, retardándose según su mayor o menor interacción con la fase estacionaria. Se utiliza el mismo eluyente durante todo el proceso, y los componentes separados se recolectan secuencialmente a la salida de la columna.

Cromatografía de Desplazamiento

En la cromatografía de desplazamiento, también se introduce un pulso de muestra en la columna. Sin embargo, después de la muestra, se introducen uno o más desplazadores (disolventes o solutos con mayor afinidad por la fase estacionaria que los componentes de la muestra). Estos desplazadores compiten por los sitios de unión en la fase estacionaria, empujando a los componentes de la muestra a través de la columna, resultando en bandas concentradas y adyacentes de los componentes puros.

Tipos Comunes de Cromatografía (según el mecanismo de separación):

• Cromatografía de Adsorción: Basada en la adhesión de los solutos a la superficie de la fase estacionaria.
• Cromatografía de Gel Filtración (o Exclusión Molecular): Separa moléculas según su tamaño hidrodinámico. Las moléculas más grandes eluyen primero porque no pueden penetrar los poros de la fase estacionaria.
• Cromatografía de Afinidad: Utiliza interacciones biológicas específicas (ej. antígeno-anticuerpo, enzima-sustrato) entre el soluto y un ligando inmovilizado en la fase estacionaria.

Cromatografía HPLC Industrial

En la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) a nivel industrial, una de las partes más críticas es el correcto empaquetamiento (llenado) de la columna. A menudo, este proceso se realiza con gran cuidado, incluso manualmente en algunas escalas, para asegurar que el lecho cromatográfico esté uniformemente compactado y no existan caminos preferentes que disminuyan la eficiencia de la separación. La calidad del empaquetamiento se verifica mediante pruebas de presión y eficiencia. El tampón (fase móvil) generalmente fluye de abajo hacia arriba a través de la columna. A la salida, el eluato pasa por un detector (por ejemplo, un espectrofotómetro UV-Vis) que monitoriza la elución de los componentes. Si un componente eluye y se detecta como puro (o alcanza la concentración deseada), el sistema puede activar una válvula para recolectar esa fracción específica.

Cristalización: Purificación por Formación de Sólidos Ordenados

La cristalización consiste en la separación de un soluto desde una disolución sobresaturada, mediante la formación controlada de cristales (sólidos con una estructura molecular altamente ordenada) en el seno de la solución. Este proceso puede alcanzar altos niveles de pureza.