Proteínas

.6.1 ULTRACENTRIFUGACIÓN:Es el MÉTODO DE REFERENCIA, pero como consecuencia del costoso equipo y especial preparación no suele utilizarse en el laboratorio normal, tan solo en laboratorios especializados o en investigación..-.-Se basa en dos propiedades poco comunes de las lipoproteínas:__Las lipoproteínas tienen densidades inferiores a cualquier otra molécula natural. __Cada clase de lipoproteínas tiene una densidad diferente.-..-.-Hay cuatro tipos de ultracentrifugación:-Secuencial -En gradiente de densidad -Mixta -Analítica.-.-.-.-.Al someter un suero a ultracentrifugación, las fracciones lipoproteicas se distribuyen a distintas alturas en el tubo de ensayo, de acuerdo con su densidad...-ñ.-La separación entre la VLDL y la LDL requiere ultracentrifugaciones de 17-20 horas y la separación de HDL de 40 horas con el riesgo de que se produzcan alteraciones estructurales de las lipoproteinas que provoquen artefactos en su separación.6.2 PRECIPITACIÓN SELECTIVA CON POLIANIONES:6.2.1 Determinación de c-HDL:El método mas extendido consiste en eliminar las lipoproteínas que contienen apo B (VLDL, LDL y Lp[a]) mediante precipitación, y medir posteriormente el c-HDL en el sobrenadante.-.-.La precipitación se produce debido a la interacción entre los grupos cargados positivamente de las apoproteínas B-100 y E, que componen las lipoproteínas, y los grupos cargados negativamente de polianiones que en presencia de más cationes divalentes (Mg2+, C2+, Mn2+) forman complejos insolubles que precipitan después de la centrifugación de la muestra de forma que sólo las HDL permanecen en el sobrenadante..-.-Los precipitantes que se utilizan son muy numerosos: - Heparina Mg+2, Ca+2 - Heparina Mn+2, Ca+2 - Dextransulfato Mg+2, Ca+2 - Ácido fosfotungstico-Mg Cl2 - Polietilenglicol-6000 - Concanavalina A.-.-.-.Seguidamente se procede a la separación de la fracción HDL por centrifugación -comprobando que se ven dos fracciones-..-.-El sobrenadante se pasa al tubo de determinación comprobando que el líquido sigue claro (en caso contrario se vuelve a centrifugar) y se procede a la cuantificación del colesterol empleando un ensayo enzimático-colorimétrico..-.-.-Un aspecto importante cuando se esta determinando colesterol-HDL es inspeccionar visualmente el tubo tras la centrifugación para asegurarse de que se ven las dos fracciones claramente separadas..-.-.El sobrenadante se pasa cuidadosamente al tubo donde se vaya a determinar el contenido en colesterol, y se vuelve a comprobar que el líquido sigue claro y no se ha aspirado erróneamente algo de infranadante. Si así hubiera sido, se vuelve a centrifugar, pues de lo contrario se cometen errores de importancia por exceso en la medida de colesterol-HDL..-.-.-Hay MÉTODOS DIRECTOS para determinar la c-HDL utilizando enzimas modificadas con polietilenglicol y sulfato de dextrano que presentan actividad catalítica selectiva frente a la c-HDL.6.2.2 Determinación de c-LDL:El c-LDL puede ser: 1) Calculada mediante la fórmula de Friedwald: .c-LDL = CT- cHDL- Tg/5 (en mg/dl) .c-LDL =CT - cHDL- Tg/2.21 (en mmol/L) .Esta fórmula es aproximadamente cierta cuando los niveles de VLDL son normales pero deja de cumplirse cuando la composición de esta familia de lipoproteínas es anormal como en las disbetalipoproteinemia y otros tipos de hipertrigliceridemias. 2) Determinada cuantitativamente con MÉTODOS DE SEPARACIÓN (ultracentrifugación o precipitación)..-.-Actualmente la determinación cuantitativa del c-LDL se realiza mediante diversos MÉTODOS ENZIMÁTICOS DE PRECIPITACIÓN. La mayoría de estos métodos se basan en la utilización de carbohidratos complejos como agentes que precipitan las LDL directamente..´-.-La heparina sin cationes divalentes (MgCl2) y a un pH 5.12 (pH en el que solo la LDL está cargada positivamente) precipita selectivamente LDL lo cual obliga a trabajar con un ajuste muy preciso de pH y por otra parte la presencia de LDL anormales (preoxidadas) con una modificación de su carga positiva pueden hacer que estas no sean precipitables..-.-El polivinilsulfato no requiere un ajuste tan preciso de pH pero este método solo parece funcionar adecuadamente con sueros normolipémicos y ligeramente hiperlipémicos ofreciendo además resultados diferentes a los de ultracentrifugación (método de referencia).6.3. DETERMINACIÓN DE QUILOMICRONES:Los principales métodos para la detección de quilomicrones son: OBSERVACIÓN DEL PLASMA. Los quilomicrones son partículas de elevado tamaño y muy baja densidad que confiere un aspecto opaco al plasma. Para ser detectables mediante observación simple deben encontrarse en cantidades muy elevadas. Es un método antiguo pero eficaz.PRUEBA DEL REFRIGERADOR. Se basa en la baja densidad de los quilomicrones de la muestra de plasma que, al ser sometida a 4ºC durante 16-18 horas, se sitúan en la parte superior formando una capa cremosa. Se requiere una elevada concentración de quilomicrones para visualizar la capa cremosa. ULTRACENTRIFUGACIÓN. Mucho más sensible que las anteriores.ELECTROFORESIS. 6.4. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS PARA DIFERENCIAR APOLIPOPROTEÍNAS:Se basan en el reconocimiento de la apoproteína, que actúa como un antígeno, mediante uno o más anticuerpos..-.-Se pueden medir por: -Inmunodifusión radial (IDR)-Radioinmunoensayo (RIA)-Enzimoinmunoensayo (ELISA)-Electroinmunoensayo (EIA): se basa en principios similares a la IDR, pero las muestras son sometidas además a electroforesis.-Inmunonefelometría: se basa en la medida de la turbidez causada por el complejo antígeno (apoproteína) - anticuerpo. Tiene la ventaja de su fácil automatización pero el inconveniente de la turbidez inherente a las muestras lipémicas. Su uso está muy extendido para cuantificar Apo A-I y Apo B en los laboratorios comunes..´-.-.-.Su determinación tiene importancia para determinar el RIESGO ATERÓGENO:--? La Apo B se encuentra sobre todo en las LDL, por lo tanto su aumento implica riesgo aterógeno. -.-.-? La Apo A-I, se encuentra sobre todo en las HDL, por lo tanto su aumento implica menor riesgo aterógeno.--.-Para la determinación de Lp(a) se utilizan: IDR, RIA, EIA, Inmunoturbidimetria. Las formas con bajo peso molecular producen concentraciones altas de Lp(a) que se relacionan con aceleración de la arteriosclerosis.6.5 ELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINAS EN ACETATO DE CELULOSA:La electroforesis se ha empleado para ayudar a la clasificación de las diferentes formas de dislipoproteinemias..-.-En la actualidad su empleo ha disminuido ya que aproximadamente un 80% de las hiperlipemias pueden ser categorizadas de forma exacta y con bajo costo mediante la interpretación del colesterol total y de los niveles de triglicéridos séricos junto con la observación del suero o plasma en la prueba de refrigeración durante 16-18 horas..-.-Si el suero o plasma refrigerados presenta quilomicrones, que se visualizan por la presencia de una capa que flota sobre la superficie, el trastorno puede clasificarse como una hiperlipoproteinemia de los tipos I o V, o más raramente del tipo III..-.-. Un suero opalescente o turbio después de la refrigeración indica principalmente presencia de partículas de VLDL, lo que sugiere una hiperlipoproteinemia de tipo IIb, IV o V.-.-..Si se observan ambas condiciones, es decir una capa cremosa flotante sobre la superficie de un suero o plasma turbio, probablemente está presente una hiperlipoproteinemia tipo V. .-.-.Sin embargo, el 25% de las muestras clínicas, en particular aquellas con hiperlipemia limítrofe, resultan difíciles de clasificar según este enfoque. Estas muestras requerirán una electroforesis o la determinación de LDL-col y HDL-col. Esto es válido, por ejemplo, en los hipercolesterolémicos limítrofes, en quienes se encuentran concentraciones de colesterol entre 250 a 275 mg/dl y un HDL-col elevado. Una persona con estos niveles aparentemente no corre riesgo de enfermedad coronaria, pero si la concentración de triglicéridos es también elevada, debe sospecharse una hiperlipoproteinemia de tipo III. En este caso la electroforesis mostrará la presencia de una banda beta ancha.7. ALTERACIONES DEL METABOLISMO DE LAS LIPOPROTEINAS:La electroforesis de las lipoproteínas (lipidograma) permite:__La verificación del AUMENTO particular de alguna fracción: Hiperlipidemia o hiperlipoproteinemia.__Determinar la AUSENCIA o DISMINUCIÓN de una de las fracciones: Hipolipidemia o hipolipoproteinemia.__Ver la respuesta de alguna BANDA ANÓMALA.En cambio no sirve para realizar un estudio de los componentes lipídicos de cada fracción lipoproteica..-.-Las alteraciones del metabolismo de las lipoproteínas pueden ser:__DISLIPEMIAS PRIMARIAS: están determinadas genéticamente y se ha identificado el defecto que las origina en alguna de ellas (no en todas). Se originan debido a la interacción de múltiples genes con factores ambientales y hormonales dando lugar a una dislipemia multifactorial.__DISLIPEMIAS SECUNDARIAS: se deben a trastornos secundarios del metabolismo de las lipoproteínas por causas metabólicas, factores dietéticos y fármacos:.-.-.Las alteraciones del metabolismo de las lipoproteínas se clasifican, siguiendo el ESQUEMA FENOTÍPICO DE FREDRICKSON en base a la interpretación de los perfiles electroforéticos que presentan las distintas hiperlipoproteinemias. Es una clasificación descriptiva y no aporta ninguna información etiológica aunque existe una clasificación genética, más actual que la anterior, que aporta información sobre la causa de la hiperlipoproteinemia/dislipoproteinemia.La CLASIFICACIÓN DE FREDICKSON se basa en las concentraciones en suero de:COLESTEROL TOTAL, TRIGLICÉRIDOS e IDL .-.-Y en el PERFIL ELECTROFORETICO y no tiene en cuenta el colesterol-HDL.--Esta clasificación no es etiológica, no diferencia hiperlipemias primarias y secundarias y hay que tener en cuanta que: una misma entidad nosológica puede presentarse con distintos fenotipos y que hay alteraciones lipoproteicas cuyo perfil no se corresponde con ninguno de los fenotipos especificados (disminución de c-HDL o aumento de la Lp(a). 8. DETERMINACIONES EN EL LABORATORIO PARA EL ESTUDIO DE LAS DISLIPEMIAS :La enfermedad cardiaca coronaria constituye uno de los principales problemas de salud de la sociedad moderna..-.-Entre los FACTORES DE RIESGO indicados hasta el momento se encuentran:Niveles plasmáticos elevados de colesterol y LDL-Niveles plasmáticos de col-HDL bajos-Niveles plasmáticos de TG elevados-Hiperglucemia -Hiperuricemia -Otros: consumo de tabaco, presión sanguínea elevada, obesidad..-.-Después de un infarto de miocardio se producen alteraciones espectaculares, con una caída inmediata del 10 al 60% en el valor de la LDL y un incremento mas gradual (10-30 días) en la concentración de VLDL. .-.-En el laboratorio clínico se determinan:__ Colesterol total__ col-HDL__ col-LDL__Triglicéridos__ Quilomicrones__ Apoproteinas __Lp(a) __Enzimas y receptores

9. ASPECTOS RELACIONADOS CON LA METODOLOGÍA DE LABORATORIO:La fiabilidad de las determinaciones de lípidos y proteínas, al igual que las medidas de otros componentes séricos, está en función directa de:9.1 La VARIABILIDAD PRE-ANALÍTICA que abarca todo el proceso previo a la realización del procedimiento analítico. Depende de:__Aspectos poblacionales: edad, sexo, raza.__Estilo de vida: tabaquismo, sedentarismo, obesidad, alcohol, café, estrés. __Variaciones estacionales intra-individuales. __Aspectos relacionados con la toma de muestras (extracción tras ayuno) y manipulación de especimenes (obtención y conservación del suero).__Aspectos secundarios a estados clínicos o tratamientos farmacológicos.La preparación del paciente exige:__Mantener el ESTILO DE VIDA HABITUAL en cuanto a su dieta, tener un peso estable las 2-3 semanas anteriores a la toma de muestras. Si se establecen medidas dietéticas a un paciente con hiperlipemia, es aconsejable esperar de 3 a 6 meses, con un mes de peso estable, para poder valorar los efectos de la dieta. __Evitar el ejercicio físico intenso las tres horas previas a la extracción. __La extracción debe retrasarse 3 semanas después de una enfermedad o 3 meses si la enfermedad es grave.__Se debe suspender cualquier medicación no imprescindibles un mes antes de la extracción. __El tabaquismo eleva las concentraciones de triglicéridos y LDL-colesterol, y baja las cantidades de apoproteina A-I y HDL-colesterol.__La ingesta moderada de alcohol suele inducir aumentos de las concentraciones de HDL-colesterol y apolipoproteina A-I. Respecto al café, los resultados son contradictorios.__La obesidad se asocia a concentraciones elevadas de colesterol total, LDL-colesterol y triglicéridos y más bajas de HDL-colesterol. Igual en el sedentarismo (se corrige con el ejercicio). __La interpretación de los resultados en una embarazada debe realizarse con cautela (son elevados). Los valores solo serán representativos tras la lactancia.__El estrés agudo provoca aumentos del colesterol total con descenso del HDL-colesterol - aconsejable que antes de la toma de muestra el paciente esté sentado y relajado durante 5 minutos-. __La concentración de triglicéridos se eleva después de la ingesta y está elevada 9-10 horas -se recomiendo el ayuno de 12 horas antes de la toma de muestras-.__Se recomienda la extracción sin torniquete o soltándolo antes 1 o 2 minutos (origina hemoconcentración y afecta a los resultados de los lípidos), con el paciente sentado y después de haber permanecido en esta postura 5 minutos previo a la extracción. Si se utiliza EDTA como anticoagulante, los valores obtenidos son un 3 % inferiores.__Obtener el suero antes de tres horas desde la toma de la muestra y realizar los análisis en suero reciente. La conservación de la muestra depende de los datos que se desea obtener: -Colesterol 20ºC: 7 días; col- HDL, 2 días; col-LDL, 1 día- 4ºC: 7 días - -20ºC: 3 meses - Triglicéridos 20ºC: 2 días - 4ºC: 7 días - -20ºC: años - Apoproteínas 20ºC: 1 día- 4ºC: 3 días -´-..-En general, la muestra se puede almacenar a 4º C hasta cuatro días y, para más tiempo, se recomienda conservar la muestra a -70º C y evitar los ciclos congelación-descongelación..-.- La variabilidad analítica es la relacionada directamente con los PROCESOS ANALÍTICOS..-.- Las fuentes de variación que inciden sobre esta fase se traducen en inexactitud e imprecisión en el proceso. Las determinaciones de lípidos y lipoproteínas deben tener un ERROR ANALÍTICO GLOBAL INFERIOR AL 10%..-.-Las recomendaciones de las diversas sociedades científicas indican la necesidad de un CONTROL DE CALIDAD EXHAUSTIVO que permita situar la inexactitud e imprecisión analítica de las determinaciones colesterol por debajo del 3%, de los triglicéridos por debajo de 5% y de las HDL inexactitud por debajo del 5% e imprecisión por debajo del 4%. .-´.-La variabilidad post-analítica se relaciona con la INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS OBTENIDOS y con las decisiones clínicas adoptadas..-´.-No se debe decidir el perfil lipoproteico sobre una sola medida aislada; deben realizarse dos determinaciones en un lapso de tiempo de 2 a 8 semanas y una tercera si los resultados de las dos anteriores son muy divergentes con diferencias superiores al 25 % para LDL-col y LDL-colesterol y al 67% para triglicéridos.-..-.El RIESGO CARDIOVASCULAR de un individuo se determina mediante la medición de colesterol total;.los que sobrepasen 200 mg/dL se completa el estudio con otras determinaciones: LDL-colesterol, HDL-colesterol y triglicéridos..-Si el nivel de triglicéridos supera 250 mg/dL el LDL-colesterol se realiza por el método de referencia..-.-.El seguimiento de un paciente, el PERFIL BÁSICO RECOMENDADO es: -Colesterol total -LDL-colesterol -HDL-colesterol -Triglicéridos.

 TEMA 13:-PROTEINAS:INTRODUCCIÓN:Las proteínas forman parte junto a glúcidos, lípidos y ácidos nucleicos de los principios inmediatos orgánicos. Están constituidas por carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno y, en menor cantidad por azufre y fósforo. Estos átomos se combinan entre sí para dar origen a unas moléculas sencillas, los aminoácidos. Hay veinte tipos distintos de aminoácidos que se unen en secuencia lineal mediante enlaces peptídicos (CO-NH) formando largas cadenas y originando los péptidos.-.-.-.La unión de dos aminoácidos forma un dipéptido, tres un tripéptido... La unión de unos pocos aminoácidos se denomina oligopéptido, más de 15 aminoácidos constituye un polipéptido y, si son más de cien los aminoácidos tenemos una proteína.-.-.-.Las proteínas puede contener entre cien y varios millares de aminoácidos y presentan una gran variedad estructural debido a las múltiples secuencias que pueden adoptar los aminoácidos que contiene que, evidentemente, se repiten muchas veces en cada molécula.2. FUNCIONES BIOLÓGICAS DE PEPTIDOS Y PROTEÍNAS:Cada ser vivo tiene unas proteínas específicas y sus distintos grupos de células presentan unas proteínas características según su función. Proteínas que desempeñan una misma función en especies diferentes presentan ligeras variaciones en su secuencia de aminoácidos. Una célula puede contener unas tres mil proteínas diferentes.-.-.Dentro de las funciones que desempeñan las proteínas en el organismo tenemos:a) Estructural: proteínas del citoesqueleto o el colágeno de la piel.b) Transporte: las apoproteínas que transportan los lípidos en el plasma o la hemoglobina que transporta oxígeno. c) Reserva: caseína de la leche. d) Contráctil: proteínas fibrilares como la actina-miosina. e) Catalítica: las enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas como por ejemplo la lisocima o la ribonucleasa. f)Hormonal: insulina, glucagón, ACTH, hormona somatotropa... g) Defensa: gammaglobulinas. h) Otras: reconocimiento celular -glucoproteínas de la membrana celular-, histonas nucleares empaquetamiento del ADN en los cromosomas-. 3. AMINOÁCIDOS:3.1 Estructura y metabolismo:Son biomoléculas caracterizadas por poseer en su molécula un grupo carboxilo (_COOH) y un grupo amino (_NH2) en el carbono a, es decir en el carbono contiguo al grupo carboxilo. Su fórmula general es: H2N-(h-C-r)-COOH.-.-.-.-..Los aminoácidos se caracterizan por la cadena lateral o radical (R) que le confiere propiedades características..-.-.Hay descritos más de un centenar de aminoácidos de los cuales 20 formarán parte de las proteínas. De los aminoácidos no proteicos podemos destacar la triyodotironina -una hormona del tiroides-, el ácido gamma-aminobutírico (GABA) -importante a nivel de SNC- y la taurina -que formará parte de los ácidos biliares-. Los demás son productos finales o intermedios del metabolismo..-.-.Los 20 aminoácidos que formarán las proteínas podemos dividirlos en aminoácidos esenciales - aquellos que no pueden ser sintetizados por el organismo y deben ser ingeridos en la dieta- y aminoácidos no esenciales -que pueden ser sintetizados por el organismo mediante la reacción de transaminación-..-.-El catabolismo de los aminoácidos tiene lugar en el músculo o el hígado y debemos considerar dos aspectos: a) la eliminación del nitrógeno mediante reacciones de transaminación o por desaminación oxidativa; el grupo amino es degradado hasta amoníaco que en el hígado se transforma en urea y glutamina. b) la cadena lateral hidrocarbonada tendrá como destino el ciclo de Kreps para la obtención de energía o la síntesis de glucosa -gluconeogénesis-. a) La reacción de transaminación consiste en el paso de grupos amino (_NH2) entre aminoácidos y cetoácidos:.-.-.-.Después de estas transferencias, el nitrógeno acaba por ser cedido al a-cetoglutarato (a-KG) que se transforma en glutamato (Glu): :.-.-.-.El glutamato pasa al interior de la mitocondria y sufre una desaminación oxidativa::.-.-.-.El amoníaco liberado es un tóxico celular que debe ser eliminado mediante su transformación en glutamina o urea o bien utilizándolo en la biosíntesis de compuestos nitrogenados.:.-.-.-.La glutamina en el riñón se hidroliza originando amoníaco libre que se elimina por orina como tal o en forma de urea: 3.2. Características ácido-básicas de los aminoácidos:Las moléculas de los aminoácidos tienen un grupo ácido (el carboxilo) y un grupo básico (el amino) que les permite que actúen como moléculas anfóteras, es decir, en función del pH del medio se comportan como ácido o como base.-.-.-.-.Al pH en que la carga eléctrica neta del aminoácido es cero (el balance de cargas positivas y negativas de la molécula es cero) se llama pH isoeléctrico o punto isoeléctrico del aminoácido.-.-.-.-.En una disolución acuosa, los grupos ionizables de los aminoácidos permiten que capte o ceda hidrogeniones según el pH del medio. En medio ácido (abundan los hidrogeniones) la molécula del aminoácido tiende a captarlos quedando cargada positivamente. Por el contrario, en medio básico (hay pocos hidrogeniones), el aminoácido tiende a liberarlos quedando cargado negativamente. 3.3.- Alteraciones de los aminoácidos:Las aminoacidopatías son anomalías del metabolismo de los aminoácidos debido a defectos enzimáticos-carencia o disfunción de un enzima-.Podemos clasificarlas en dos grupos:a) Defectos del transporte de los aminoácidos:__a nivel renal: disminución de la reabsorción renal del aminoácido, por ejemplo, cistinuria.__A nivel intestinal: disminución de la absorción de aminoácidos.b) Alteraciones del catabolismo de los aminoácidos:__Fenilcetonuria.__Albinismo.__Transtornos del ciclo de la urea.-.-.-.El primero de los grupos se caracteriza por un descenso en los niveles plasmáticos de los aminoácidos afectados o sus metabolitos mientras que en el segundo se produce una elevación de los mismos. Cistinuria:Es un defecto hereditario de los túbulos renales que consiste en una alteración en la reabsorción del aminoácido cistina con incremento de su eliminación urinaria y formación de cálculos renales.Fenilcetonuria:Defecto congénito del metabolismo de los aminoácidos que se caracteriza por una ausencia casi total de la enzima fenilalanina hidroxilasa con elevación de la fenilalanina en el plasma que origina a menudo retraso mental.Albinismo:Defecto hereditario -autosómico recesivo- del aminoácido tirosina por defecto de la enzima tirosinasa y cursa con ausencia de pigmento en la piel, el pelo y los ojos.