Protocolo Detallado para la Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos

EDTA: agente quelante que inhibe nucleasas al secuestrar cationes esenciales como Mg²⁺. Agentes caotrópicos: desestabilizan proteínas y también ayudan a inactivar nucleasas. En el caso de células con pared celular (como bacterias y hongos), se requieren pasos adicionales: Tratamientos enzimáticos con lisozima o liticasa. Métodos físicos como ebullición, ciclos de congelación/descongelación o sonicación. Para aislar el ADN genómico, se puede usar el detergente CTAB, que ayuda a separar este del resto del contenido celular.//  3. Purificación de los ácidos nucleicos Una vez liberados, los ácidos nucleicos deben ser purificados para eliminar proteínas, lípidos, y otros contaminantes del lisado celular.A) Extracción con solventes orgánicos Se emplea una mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico, que permite separar los componentes celulares en dos fases:Fase acuosa superior: contiene los ácidos nucleicos y sales. Fase orgánica inferior: contiene proteínas, lípidos y otros residuos (que se eliminan).B) Precipitación del ADN: Se transfiere la fase acuosa a un nuevo tubo y se añade acetato sódico y etanol 100 % o isopropanol frío. Se centrifuga para precipitar el ADN, que forma un sedimento blanco en el fondo del tubo.Se lava con etanol al 70–95 % para eliminar residuos solubles  c) Secado y resuspensión: Se elimina el etanol restante secando la muestra al aire o con papel absorbente. Finalmente, el ADN se resuspende en agua destilada o en tampón TE (Tris-EDTA), que ayuda a conservar la estabilidad del ADN.// 4. Procesado final de los ácidos nucleicos Después de la purificación, se evalúan varias carácterísticas fundamentales para confirmar la calidad del material extraído: Integridad:  Se evalúa mediante electroforesis en gel de agarosa, observando si el ADN mantiene su tamaño original o presenta fragmentación (efecto “smearing”). Pureza:  Se determina midiendo la absorbancia a 260 nm con un espectrofotómetro. La relación A260/A280 permite estimar la contaminación con proteínas. Concentración: Se mide la cantidad de ADN o ARN por unidad de volumen, útil para preparar futuras reacciones moleculares (PCR, secuenciación, etc.).  Almacenamiento y trazabilidad: Para conservar la integridad del material: Menos de 24 h: a 4 °C. 4–5 días: a -20 °C. Largo plazo: a -80 °C. ARN: siempre entre -20 y -80 °C debido a su alta inestabilidad. Se debe asegurar una correcta identificación y trazabilidad mediante etiquetas, códigos alfanuméricos, códigos de barras o códigos QR.