Protocolo Detallado para la Purificación de Ácidos Nucleicos Mediante Cromatografía

A continuación, se describen los pasos clave en la purificación de ácidos nucleicos, diferenciando entre métodos basados en gradientes de salinidad y la cromatografía de adsorción.

Método Basado en Concentración Salina Creciente

1. La columna se lava con tampones de concentración salina creciente. Con esto, se van eliminando aquellas moléculas que están unidas a la fase estacionaria, pero que tienen una carga neta (-) débil.
2. El ADN se eluye de la columna con un tampón de máxima salinidad y alto pH.
3. Lavado y precipitación de los ácidos nucleicos: Se realiza con isopropanol o etanol para eliminar las sales del tampón de elución. Posteriormente, se resuspenden en agua destilada o tampón TE.

Nota: Si se juega con la concentración salina, es posible eluir otras moléculas específicas.

4.3.2. Cromatografía de Adsorción

Fundamentación Teórica

Este método se basa en la capacidad de adsorción (capacidad de pegarse) de los ácidos nucleicos al vidrio o a la sílice (fase estacionaria) en presencia de sales caotrópicas.

Concepto de Sales Caotrópicas

Las sales caotrópicas son sustancias que desorganizan la red tridimensional de las moléculas de agua, y por tanto, sus interacciones con otras moléculas disueltas. Ejemplos incluyen: urea, tiourea, y cloruro de guanidinio.

Mecanismo de Adsorción

1. En contacto con el agua, la fase estacionaria (vidrio o sílice) se hidrata, recubriéndose de una capa de agua.
2. La muestra de ADN también se hidrata, recubriéndose de una capa de agua.
3. Las capas hidratantes de ambos elementos impiden la interacción entre ellas.
4. Cuando al medio se añade una sal caotrópica, esta atrae las moléculas de agua y retira las capas hidratantes de ambas estructuras $\rightarrow$ Interacción entre el ADN y la fase estacionaria (adsorción).

Pasos del Procedimiento de Adsorción

1. Cargar columna: Se carga la columna con la muestra diluida en un tampón que contenga un agente caotrópico y se centrifuga.
   • Los ácidos nucleicos quedan unidos a la columna (adsorción).
   • Las proteínas y componentes celulares contaminantes se eluyen.
2. Lavar columna: Se lava la columna con etanol al 70% para eliminar restos contaminantes.
   • Para esto, se carga la columna con etanol, se centrifuga y se elimina lo eluido.
   • Para evitar que queden restos de alcohol, la columna vacía se somete a una nueva centrifugación y el tubo recolector se desecha.
3. Elución del Ácido Nucleico Purificado: Se carga la columna con agua destilada o tampón TE. De esta manera, como las moléculas de ácidos nucleicos recuperan la capa hidratante, las moléculas de ADN y los grupos funcionales de la fase estacionaria vuelven a separarse.
   • Dejar un periodo corto de incubación y centrifugar.
   • En el tubo eppendorf se recolecta el ácido nucleico purificado.