Protocolo de Extracción de ARN y SDS-PAGE

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)

Preparación del gel de resolución (15%): (Para 10 ml de gel)

• 2.3 ml Agua destilada
• 2.5 ml Tampón Tris-HCL 1.5 M, pH 8.8
• 0.1 ml SDS 10%
• 5.0 ml Acrilamida/Bis-acrilamida (30% T, 2.6% C)
• 4.0 µl TEMED
• 0.1 ml Persulfato de amonio 10%

Preparar los geles de acuerdo al protocolo anterior y dejar polimerizar entre 10 a 15 minutos.

Colocar las tiras de IPG sobre la superficie superior del gel y sellarlas con una solución de agarosa 0.5% y azul de bromofenol 0.002% en tampón de corrida (Tris-HCL 25 mM, pH 8.3, glicina 192 mM, SDS 0.1%). Dejar solidificar durante 5 minutos.

Realizar la corrida electroforética con tampón de corrida, durante 1 h a 200 V.

Tinción con Nitrato de Plata

• Colocar los geles en una solución de etanol 30%, ácido acético 10% durante 30 minutos.
• Lavar los geles 3 veces con etanol 30% durante 15 minutos cada lavado.
• Colocar los geles en una solución de bisulfato de sodio 2.5 mM e incubar durante 2 min.
• Lavar los geles 2 veces con agua destilada durante 5 minutos cada lavado.
• Sumergir los geles en una solución de nitrato de plata 0.2% con formaldehído al 37% durante 30 min.
• Lavar los geles con agua destilada durante 1 min.
• Colocar los geles en una solución de carbonato de sodio 3% con formaldehído al 37% y tiosulfato de sodio 2.5 mM hasta la aparición de las bandas.
• Detener la reacción con ácido acético 10%.

Capturar la imagen en un fotodocumentador (ChemiDoc XRS, Bio-Rad) y analizar los spots. Para la estimación del peso molecular, utilizar una mezcla de proteínas de peso molecular conocido: fosforilasa b (97.4 kDa), albúmina sérica bovina (66.3 kDa), deshidrogenasa glutámica (55.4 kDa), deshidrogenasa láctica (36.5 kDa), anhidrasacarbónica (31 kDa), inhibidores de tripsina (21.5 kDa) y lisozima (14.4 kDa).

Extracción de ARN de Plantas

Protocolo con CTAB

• Preparación del buffer CTAB: 2% (w/v) CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, 1% PVPP.
• Pulverizar de 10 a 30 mg de tejido foliar seco (usar nitrógeno líquido, hielo seco o secar en campana al vacío con sílica gel).
• Añadir buffer CTAB precalentado a 60°C, mezclar y incubar de 10 a 60 minutos a 60°C (agitar cada 10 minutos).
• Añadir cloroformo:isoamil alcohol (24:1), mezclar, centrifugar a 10,000 rpm por 10 minutos a 4°C. Recuperar el sobrenadante.
• Añadir RNasa A (10 mg/ml) e incubar 30 minutos a 37°C.
• Añadir cloroformo:isoamil alcohol (24:1), mezclar, centrifugar a 10,000 rpm por 10 minutos a 4°C. Recuperar el sobrenadante.
• Añadir 0.6 volúmenes de isopropanol helado, mezclar y centrifugar a 8,000 rpm por 10 minutos. Descartar el sobrenadante.
• Lavar el precipitado con solución de lavado (10 mM acetato de amonio, 70% etanol), centrifugar a 8,000 rpm por 10 minutos y secar a temperatura ambiente.
• Resuspender en 0.5 ml de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA), añadir 1/10 volumen de acetato de sodio 3M, mezclar y añadir 2 volúmenes de etanol absoluto helado.
• Centrifugar a 5,000 rpm por 10 minutos. Resuspender en 0.5 ml de TE. Conservar a 4°C.

Protocolo con GuSCN

Adición después de la lisis celular:

• Añadir 750 µl de GuSCN 6M, agitar y centrifugar a 2,000 g por 10 minutos. Transferir el sobrenadante.
• Precipitar el ARN con 0.1 volúmenes de acetato de sodio y 2.5 volúmenes de etanol frío, o realizar extracción con fenol.

Adición antes de la lisis celular:

• Lisar las bacterias con GuSCN y sonicación. Agregar detergente después de la sonicación.
• Resuspender el precipitado bacteriano en 1 ml de citrato de sodio 4M + GuSCN + β-mercaptoetanol durante 20 segundos.
• Añadir 50 µl de Sarkosyl al 10%, agitar y centrifugar a 12,000 g por 10 minutos.
• Precipitar el ARN o extraer con fenol en presencia de acetato de sodio y fenol ácido.
• Añadir secuencialmente: 0.1 volúmenes de acetato de sodio 2M (pH 4.0), 1 volumen de fenol saturado en agua y 0.2 volúmenes de cloroformo:alcohol isoamílico (49:1, v/v). Agitar y centrifugar a 12,000 g por 10 minutos.
• Precipitar el ARN en la fase acuosa con 2.5 volúmenes de etanol o 1 volumen de isopropanol a -20°C.