Pruebas cruzadas y Microlinfocitotoxicidad en trasplantes de órganos

Pruebas cruzadas

Cuando hay un donante potencial, se selecciona en función de parámetros clínicos (gravedad de los pacientes y tiempo de espera, sobre todo) y datos de los tipajes de HLA a una serie de posibles receptores. Normalmente, los laboratorios cuentan con un banco de sueros de los pacientes en lista de espera para trasplante, de manera que, tras la selección de candidatos, se recuperan los sueros del banco para realizar las pruebas.

Los sueros son enfrentados a linfocitos del donante que pueden proceder de un ganglio, del bazo, e incluso, de sangre periférica si no hay se ha indicado que haya sido transfundido.

Obtenidas las células del donante, son enfrentadas a diluciones de los sueros de los diferentes candidatos en un ensayo de linfotoxicidad equiparable a la que se ha estudiado en el apartado anterior. Se observan los pocillos en microscopio invertido para poder cuantificar la viabilidad con azul tripán.

- Lisis superior al 20%: es positiva la prueba cruzada y se determinará que donante y receptor no son compatibles, por lo que se desaconseja el trasplante.

Lisis inferior al 20%: la prueba es negativa y la recomendación es la realización del trasplante.

La realización de pruebas cruzadas se lleva a cabo a la hora de afrontar un trasplante para verificar que existe histocompatibilidad entre el receptor y el posible donante que indique que es posible realizar un trasplante exitoso que no conduzca al rechazo del órgano injertado. De no realizarse este tipo de pruebas, el índice de rechazo sería altísimo.

Microlinfocitotoxicidad

Se trata de un método serológico muy empleado, sobre todo para la tipificación de HLA de clase, pues es bastante sencillo de realizar y resulta rápido y económico. Consiste en incubar linfocitos procedentes de la muestra problema con una batería de anticuerpos monoclonales específicos de las diferentes moléculas de HLA.

Aspectos técnicos:

Los anticuerpos anti-HLA resultan bastante específicos para los determinantes estructurales característicos de las diferentes moléculas HLA. La interacción antígeno-anticuerpo en presencia de factores de complemento induce la lisis celular. De manera que en los pocillos en los que esta se verifique es donde se han colocado anticuerpos frente a una de las moléculas HLA que el paciente expresa.

Para verificar dónde se ha producido la lisis, se añade el colorante azul tripán que solo colorea las células lisadas y se observa la placa en microscopio invertido. En los pocillos en los que las células se han teñido con azul tripán, estarían presentes los anticuerpos anti-HLA de una de las moléculas HLA que exprese el individuo estudiado, de manera que se determina que esa molécula forma parte de su haplotipo. En los pocillos en los que las células no han sido lisadas (no se tiñen), estarían los anticuerpos frente a moléculas HLA no presentes en el individuo.

Establecer el perfil de expresión de moléculas HLA presentes en un individuo es vital a la hora de afrontar un trasplante de órganos o tejidos como la médula ósea, tanto para el receptor como para el donante, pues ambos han de expresar moléculas HLA compatibles para asegurar el éxito del procedimiento.

Determinar ag HLA para transplantes de órganos

Si se trasplanta un órgano o un tejido entre dos personas histoincompatibles que, por tanto, poseen alelos CMH diferentes, los linfocitos T CD4 y CD8 del receptor reconocen como extrañas a las moléculas HLA del donante, produciendo una intensa reacción inflamatoria y la destrucción de las células extrañas. Esta respuesta se conoce como respuesta alogénica. Además, esta respuesta incluye la síntesis de anticuerpos contra las moléculas del CMH del donante. Estas reacciones pueden reproducirse in vitro en la técnica de cultivo mixto linfocitario.

Otras aplicaciones del tipaje HLA son:

• Utilización del polimorfismo HLA en la asociación con patologías autoinmunes.
• Estudio de los alelos asociados y del riesgo relativo entre HLA y enfermedad.
• Empleo del polimorfismo HLA en medicina legal.
• Uso HLA en estudios de poblaciones.

Los estudios de paternidad no permiten afirmar si los individuos estudiados son, efectivamente, padre e hijo, pero pueden descartar la relación en determinadas ocasiones. Por ejemplo, una persona con grupo AB no puede tener un hijo de grupo 0, o viceversa. Pero no puede afirmarse o descartarse que exista parentesco entre dos individuos de grupo A, por ejemplo.

Posteriormente, fueron alineándose los estudios incluyendo otros antígenos eritrocitarios como el sistema Rh, pero seguían siendo considerados estudios de exclusión. Los estudios serológicos de HLA que permiten un mayor afinado en la determinación de la paternidad. El sistema HLA se hereda en haplotipos y siguiendo un patrón mendeliano de manera que, de una pareja de progenitores, la descendencia sólo puede expresar determinadas combinaciones.

Aunque son estudios que dan resultados más afinados, de nuevo, son más útiles como ensayos de exclusión que de afirmación. En la determinación de los sistemas HLA, los estudios de biología molecular fueron ganando importancia y los estudios de paternidad basados en la determinación de estos sistemas fueron sustituidos paulatinamente por estudios genéticos (estudios de repeticiones de ADN microsatélite y de repeticiones en tándem, sobre todo) más certeros en la determinación de paternidades.