Purificación y Caracterización de Proteínas: Métodos y Enzimas Clave

Factores que Desestabilizan Proteínas

Diversos factores pueden afectar la estabilidad de las proteínas, incluyendo:

• pH: Valores óptimos generalmente entre 7 y 8.
• Temperatura: Las bajas temperaturas suelen ser más favorables.
• Proteasas: Enzimas que degradan proteínas (son metaloenzimas y necesitan iones como cofactores).
• Contaminación microbiana: Los microorganismos pueden degradar las proteínas.

Electroforesis: Separación de Moléculas Cargadas

La electroforesis es un proceso que separa moléculas con carga neta bajo la influencia de un campo eléctrico. La fuerza que impulsa a las macromoléculas cargadas es el potencial eléctrico aplicado. Las proteínas, al ser moléculas con carga, se moverán en un campo eléctrico a una velocidad directamente proporcional a su carga e inversamente proporcional a su masa. El parámetro clave que determina la movilidad es la relación carga/masa.

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE)

Los geles de poliacrilamida se forman por polimerización inducida por radicales libres. El tamaño de los poros se puede regular variando la concentración de los compuestos polimerizantes: a mayor concentración, menor tamaño de poro. El gel actúa como un tamiz molecular.

SDS-PAGE: Separación por Masa Molecular

SDS-PAGE (electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) separa proteínas (o subunidades) según sus masas moleculares. El SDS, un detergente aniónico, desnaturaliza las proteínas y se une a ellas en una proporción constante, otorgando a los complejos SDS-proteína una carga negativa proporcional a la masa. Esto resulta en una relación carga/masa uniforme para todas las proteínas. El SDS desestructura las proteínas y separa las subunidades no unidas covalentemente. Se puede añadir β-mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro.

Cromatografía de Afinidad: Separación por Unión Específica

Separa las proteínas por su capacidad de unión específica a otras moléculas. El proceso general implica:

1. Una columna que contiene un ligando específico para la proteína de interés, fijado a un polímero (fase estacionaria).
2. La proteína se une al ligando, mientras que las proteínas no deseadas se eliminan por lavado.
3. Una solución concentrada de ligando libre eluye la proteína de interés.

Inmunoafinidad

Utiliza anticuerpos unidos covalentemente a la fase estacionaria. Permite una purificación de hasta 10000 veces en un solo paso. El desafío principal es encontrar las condiciones adecuadas para separar la proteína unida al anticuerpo.

Enfoque Isoeléctrico: Separación por Punto Isoeléctrico

Separa las proteínas según su punto isoeléctrico (pI). El procedimiento es:

1. Se establece un gradiente de pH estable en el gel aplicando un campo eléctrico.
2. Se añade la solución de proteínas y se vuelve a aplicar el campo eléctrico.
3. Las proteínas se distribuyen a lo largo del gradiente según su pI.

Electroforesis Bidimensional: Separación por pI y Masa

Permite separar hasta 1000 proteínas diferentes en un mismo experimento. Combina:

1. Enfoque isoeléctrico (primera dimensión).
2. SDS-PAGE (segunda dimensión, separación por masa molecular).

Secuenciación de Proteínas y Plegamiento

Sanger y Tuppy determinaron la secuencia primaria de una proteína. Szent-Györgyi dijo: "Ver lo que todo el mundo ha visto y pensar lo que nadie ha pensado".

Proteínas accesorias de plegamiento:

• Isomerasa de puentes disulfuro (PDI): Acelera el reordenamiento de puentes disulfuro (6000 veces).
• Peptidil-prolil isomerasa (PPI): Cataliza la isomerización cis/trans de enlaces peptídicos en los que participa la prolina.
• Chaperonas moleculares (chaperonas y chaperoninas): Proteínas que asisten en el plegamiento.

Función de las Chaperonas Moleculares

• Evitan plegamientos prematuros o agregación.
• Evitan interacciones entre subunidades antes de alcanzar la estructura terciaria.
• Mantienen las proteínas desplegadas para atravesar membranas.
• Evitan la hidrólisis de enlaces peptídicos.
• Participan en el replegamiento de proteínas parcialmente desplegadas. Si el replegamiento no es posible, intervienen en la degradación.

Colágeno: La Proteína Estructural Abundante

Es la proteína animal más abundante. Contiene glicina, prolina e hidroxiprolina. La prolina impide la formación de hélices alfa. Forma una estructura de triple hélice (tropocolágeno) con conformación helicoidal hacia la izquierda (3.3 aminoácidos por vuelta). Cada tercer residuo pasa por el centro de la triple hélice, por lo que solo se adapta la cadena lateral de la glicina. Se forman puentes de hidrógeno intercatenarios que estabilizan la estructura. Las moléculas de tropocolágeno se asocian para formar fibrillas, unidas transversalmente por enlaces covalentes cruzados.

Propiedades de las Enzimas

• Gran poder catalítico.
• Condiciones de reacción suaves.
• Alta especificidad de sustrato y reacción.
• Capacidad de regulación.
• Las enzimas no alteran el equilibrio de la reacción.

Coenzimas: Componentes Esenciales para la Catálisis

Moléculas con propiedades fisicoquímicas que no se encuentran en la cadena polipeptídica de la enzima y actúan junto con ella para catalizar una reacción. Si la coenzima es un ion metálico, se denomina cofactor, y las enzimas correspondientes son metaloenzimas. Cuando las coenzimas están unidas covalentemente a la enzima, se denominan grupos prostéticos. Holoenzima es la enzima funcional completa con su coenzima. Apoenzima es el componente proteico de la enzima. La mayoría de las coenzimas son formas modificadas de vitaminas (las vitaminas hidrosolubles son precursoras). Ejemplos: Biotina (transcarboxilación), B12 (transferencia de grupos metilo).

Importancia de los Estudios Cinéticos Enzimáticos

• Determinan la afinidad de unión de sustratos e inhibidores a una enzima y la velocidad catalítica máxima.
• Permiten conocer el mecanismo catalítico de una enzima.
• Ayudan a entender el papel de una enzima en una vía metabólica y su regulación.
• La velocidad (v) de una reacción catalizada por una enzima es proporcional a la cantidad de enzima presente.

Factores que Afectan la Velocidad de Reacción

• Concentración de sustrato y enzima.
• Presencia de activadores e inhibidores.
• pH y temperatura.

Significado de la Constante de Michaelis (Km)

1. Relaciona las constantes de velocidad de la reacción (Km varía de una enzima a otra, típicamente entre 10^-1 y 10^-6 M, y depende de cada sustrato, temperatura, pH y fuerza iónica).
2. Establece un valor aproximado del nivel intracelular del sustrato.
3. Puede asociarse con la afinidad de la enzima por el sustrato (cuando k_-1 es mucho mayor que k₂, entonces Km ≈ Ks).

kcat y Eficiencia Catalítica

kcat es la constante de velocidad global para la transformación de sustrato (S) en producto (P). El número de recambio es el número de moléculas de S transformadas en P por unidad de tiempo por una molécula de enzima saturada con S. La eficiencia catalítica (kcat/Km) sirve para discriminar entre sustratos que compiten por la misma enzima. Cuando la concentración de S es mucho menor que Km, se forma poco complejo ES y la mayoría de la enzima estará libre.

Inhibición Enzimática

Moléculas que interfieren con la catálisis, enlenteciendo o deteniendo las reacciones enzimáticas.

• Reversible: Implica unión no covalente al centro activo (CA), facilitando la disociación. Puede ser:
  • Competitiva: El sustrato (S) y el inhibidor (I) compiten por unirse al CA.
  • No competitiva: I y S se unen a sitios diferentes de la enzima (E).
  • Acompetitiva: I se une solo al complejo ES, formando un complejo ESI inactivo.
• Irreversible: El inhibidor queda covalentemente unido a la enzima o ligado tan fuertemente que su disociación es muy lenta. Algunos inhibidores irreversibles, como el DFP o el gas sarín, se parecen químicamente al estado de transición del sustrato (análogos del estado de transición). Son marcadores de afinidad. Los inhibidores suicidas son poco reactivos hasta que se unen al CA de una enzima específica. En lugar de ser convertido en el producto normal, el inhibidor suicida se convierte en un compuesto muy reactivo que se combina irreversiblemente con la enzima.

Aspartato Transcarbamilasa: Un Ejemplo de Regulación Enzimática

Tiene 12 subunidades: la mitad catalíticas (donde se une el sustrato) y reguladoras (donde se une un inhibidor, CTP, o un activador, ATP, que compiten por el mismo sitio).

Zimógenos: Precursores Inactivos de Enzimas

Enzimas que se sintetizan como precursores inactivos. La forma activa se produce por hidrólisis irreversible de uno o varios enlaces peptídicos. Ejemplo: pepsinógeno → pepsina. Estas enzimas se encuentran en el páncreas y no regresan allí; de lo contrario, se degradarían como aminoácidos.