Replicación del ADN: Modelos, Experimentos Clave y Orígenes
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Se consideraron tres posibles modelos para el mecanismo de la replicación hasta que se demostró que la replicación es semiconservadora:
- Semiconservadora (modelo correcto): Cada molécula hija conserva una de las cadenas originales.
- Conservadora: Se sintetiza una molécula totalmente nueva, copia de la original.
- Dispersora o Dispersante: Las cadenas hijas constan de fragmentos de la cadena antigua y fragmentos de la nueva.
Experimento de Meselson y Stahl
El experimento de Meselson y Stahl en 1958 demostró que el mecanismo real se ajusta a la hipótesis de replicación semiconservadora. Se cultivaron células de Escherichia coli en presencia de nitrógeno-15, un isótopo del nitrógeno más pesado de lo habitual. El isótopo se incorporó a las cadenas de ADN que se sintetizaban, haciéndolas más pesadas.
Luego, las células fueron transferidas a un medio con nitrógeno-14 (más ligero), donde continuaron su crecimiento. Se purificó el ADN y se analizó mediante centrifugación en gradiente de cloruro de cesio, donde la densidad es mayor en el fondo del tubo.
En la primera generación se obtuvo una única banda de ADN con densidad intermedia. En la segunda generación se obtuvieron dos bandas, una con densidad ligera y otra intermedia o híbrida. En la tercera generación se obtuvieron dos bandas, una ligera (75%) y otra intermedia (25%).
La banda intermedia o híbrida representa una molécula de ADN con una cadena pesada (original) y otra ligera (recién sintetizada). Las cadenas ligeras representan una molécula de ADN donde ambas cadenas han sido sintetizadas en presencia de nitrógeno-14.
El aumento de moléculas ligeras y el mantenimiento del número de moléculas intermedias demuestran que la replicación del ADN es semiconservadora. Si fuera conservadora, aparecería siempre una banda pesada y el resto ligeras. Si fuera dispersante, solo aparecerían bandas híbridas de densidad intermedia en todas las generaciones.
Replicación Secuencial y Bidireccional
Los orígenes de replicación son los puntos fijos desde los cuales se lleva a cabo la replicación, que avanza de forma secuencial formando estructuras con forma de horquilla. La replicación es bidireccional, es decir, a partir de cada origen se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos.
El genoma bacteriano es un replicón único circular. En organismos eucarióticos, la replicación del ADN se inicia en múltiples orígenes a la vez (aproximadamente uno cada 20 kb), es decir, hay varios replicones.
En las células eucariotas hay varios replicones.
Experimento de Cairns
Los experimentos de Cairns (1963) con bacterias Escherichia coli determinaron la existencia de un punto fijo u origen de replicación. Se cultivó E. coli en un medio con timidina tritiada (timina marcada con tritio), marcando radiactivamente el ADN para realizar una autorradiografía. La observación al microscopio indicó que la replicación en E. coli se iniciaba en un punto concreto (OriC).
Secuencialidad
Sueoka y Yoshikawa (1963) realizaron estudios genéticos de complementación de mutaciones que determinaron que la replicación avanza de forma secuencial desde los orígenes. Trabajaron con Bacillus subtilis porque era posible obtener cultivos sincronizados de forma que todas las células del cultivo estuvieran en la misma fase del ciclo celular. El método consistía en la conjugación bacteriana de cepas silvestres con cepas mutantes.