Requisitos y Procedimientos en el Estudio Micólogico

Requisitos básicos para la recogida y transporte de muestras

• Es necesario recoger las muestras asépticamente y utilizando instrumental estéril.
• No se deben usar hisopos para la recogida y transporte de las muestras, salvo que no haya una opción mejor, ya que los filamentos del hisopo se pueden confundir con hifas.
• Las muestras dermatológicas se pueden transportar en seco.
• No se deben utilizar medios de transporte.
• No se debe añadir ningún conservante.
• Las muestras que no se siembran inmediatamente deben ser sembradas en un máximo de dos horas tras la obtención.
• Excepto en los casos en que haya protocolos establecidos, lo habitual es transportar a temperatura ambiente.

Pasos para la identificación de un hongo en el laboratorio

Antes de llevar a cabo la observación microscópica y el cultivo, es necesario preparar las muestras. El primer paso es la observación macroscópica, para detectar la presencia de gránulos, material caseoso, purulento, hemorrágico o necrótico. A partir de esta observación, se selecciona una parte representativa. Seguidamente, se prepara la muestra para la posterior observación al microscopio y siembra en medios de cultivo:

• Los tejidos se trocean con tijeras o bisturí, y los pequeños trozos se inoculan en el medio de cultivo.
• Los fragmentos ungueales se trocean progresivamente con un bisturí y se pulverizan.
• Las muestras altamente viscosas deben fluidificarse, pero sin diluirlas excesivamente.
• Los líquidos orgánicos u otras muestras muy diluidas se pueden concentrar por centrifugación.

Examen en fresco: definición y aplicación

El examen microscópico en fresco es útil en muestras de piel y material ungueal. Para llevarlo a cabo, se deposita una pequeña cantidad de muestra sobre un porta y se le adicionan unas gotas de solución de hidróxido potásico (KOH). El KOH disuelve la queratina y digiere parcialmente el componente proteico celular, pero no ataca a la pared de polisacáridos de los hongos, lo que facilita la visualización.

Tinción de tinta china: estructuras visualizables

La tinción de tinta china permite detectar esporas y levaduras encapsuladas. La cápsula que rodea las levaduras impide el paso del colorante, por lo que se observan como burbujas brillantes en un fondo negro. Esta técnica es especialmente útil en sospechas de infección por Cryptococcus neoformans.

Adición de antimicrobianos en medios de cultivo

Se adicionan antimicrobianos a los medios de cultivo de hongos para el aislamiento de los mismos. El medio con cicloheximida inhibe muchos hongos contaminantes, lo que ayuda a cultivar muestras cutáneas.

Preparación de un medio de cultivo sólido en placas de Petri

Al igual que los medios para bacterias, la mayoría de los medios de cultivo para hongos que se utilizan son productos comercializados, que se presentan en forma de polvo. Para prepararlos, se deben seguir las instrucciones del fabricante, respetando las proporciones, los disolventes y las temperaturas. El procedimiento se desarrolla en las siguientes fases:

• Algunos antibióticos deben añadirse al medio cuando este haya sido esterilizado y la temperatura haya bajado suficientemente.
• Las placas con el medio ya solidificado se deben sellar con cinta adhesiva para que no se abran accidentalmente.
• Para prevenir la desecación, se recomienda colocarlas en posición invertida dentro de bolsas de plástico.
• Suelen conservarse en buen estado unos 3 meses.

Tiempo y temperatura de incubación en cultivos de hongos

Las placas o tubos sembrados se disponen en estufas de incubación durante el tiempo que corresponda. Las placas sembradas se deben sellar con una cinta adhesiva que evite contaminaciones o aperturas accidentales, pero que permita el intercambio gaseoso. En el interior de la estufa debe haber un cierto nivel de humedad para evitar la desecación de los cultivos. La temperatura óptima de crecimiento de la mayoría de los hongos patógenos, especialmente los que infectan la piel, es de 30ºC; para los hongos dimórficos y algunos otros patógenos es de 37ºC. Los cultivos no deben desecharse cuando se aísla un hongo, sino que se debe completar el periodo de incubación.