Secuenciación Automática y Masiva de ADN: Métodos Sanger y NGS
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Secuenciación Automática de ADN: Método Sanger
Fluorescencia y Automatización
La secuenciación automática de ADN por el método de Sanger utiliza fluoróforos en lugar de autorradiografía para la detección de las bandas. La posibilidad de usar un fluoróforo distinto en las cuatro reacciones (ddNTPs) permite la automatización completa del proceso y la lectura simultánea de las hebras marcadas.
Interpretación de la Secuencia
Es crucial considerar el tipo de primer utilizado. Si se usa un primer forward, la secuencia obtenida coincide con la cadena 5’—3’ de la molécula. Si se usa un primer reverse, la secuencia obtenida es la complementaria y en sentido inverso de la secuencia 5’—3’ que representa la molécula a secuenciar.
Electroforesis Capilar
La incorporación de la electroforesis capilar permite la separación de los productos de elongación con mayor rapidez y resolución. Este método requiere cantidades mínimas de muestra y trabaja a alto voltaje.
El proceso implica una PCR en un solo tubo con los cuatro ddNTPs marcados con fluorocromos. Al finalizar, el tubo contiene una mezcla de fragmentos marcados que se cargan directamente en el secuenciador.
Secuenciación Masiva (NGS)
Características Principales
Las técnicas de secuenciación masiva (NGS), desarrolladas después del Proyecto Genoma Humano, se caracterizan por:
- Mayor capacidad de procesamiento de muestras en paralelo.
- Reducción del tiempo de secuenciación.
- Menor coste por base secuenciada.
Comparación con la Secuenciación Sanger
Mientras que los secuenciadores de primera generación (como el método Sanger) permiten secuenciar fragmentos de hasta 1.000 bases, la NGS busca secuenciar fragmentos mucho mayores.
Fases de la Secuenciación Masiva
La secuenciación masiva se divide en tres fases principales:
Preparación de los Moldes
El ADN se fragmenta y se le añaden adaptadores (oligonucleótidos sintéticos) a los extremos. Estos adaptadores permiten la amplificación de todos los fragmentos con la misma pareja de cebadores.
La amplificación, generalmente por PCR, es crucial para la detección lumínica. Se utilizan diferentes métodos de inmovilización del ADN durante la amplificación:
- Inmovilización de cebadores.
- Inmovilización de las moléculas de ADN amplificado.
- Fijación de moléculas de polimerasa al soporte.
Reacciones de Secuenciación y Detección
Esta fase presenta la mayor variabilidad entre los distintos sistemas de NGS. Una técnica común es la terminación reversible cíclica, que utiliza una ADN polimerasa y nucleótidos terminadores bloqueables. La adición de un nucleótido correcto genera una señal detectable gracias a un fluoróforo unido.