Secuenciación de genomas: Tecnologías y aplicaciones

Secuenciación de Genomas

Tecnologías de secuenciación

Secuenciación de Segunda Generación

Plataforma automática para la secuenciación de genomas complementarios individuales basada en diferentes tecnologías que obtienen resultados en poco tiempo y bajo coste.

• Reversible Cíclica:
  1. Adición de los nucleótidos terminantes al pocillo.
  2. Fijación de un nucleótido a la vez a cada amplicón.
  3. Se lava el pocillo para eliminar los nucleótidos no adheridos.
  4. Se repite un nuevo ciclo.
  5. Se fija un nuevo nucleótido terminante.
  6. La fluorescencia emitida por cada nucleótido es leída.
• PCR Puente:
  • Fase de hibridación: El adaptador del extremo libre de cada fragmento de ADN molde híbrida con el 1º universal complementario más próximo, formando un puente sobre la superficie.
  • De extensión: Se genera la doble hebra.
  • De desnaturalización: Se separan, permaneciendo ancladas a la superficie y muy próximas físicamente.

Secuenciación Sanger (1ª generación)

Método enzimático de terminación de cadena Sanger y el uso de 4 fluoróforos como marcadores.

• Por terminación fluorescente:
  • Marcar los 4 dNTP con un fluoróforo distinto.
  • Añadir al tubo 4 dNTP marcados en porción adecuada.
• Primers fluorescentes:
  • Utiliza el mismo primer, cada tubo marcado con un fluoróforo distintivo.
  • Añadir mezcla de reacción con dNTP en menor porción, color distinto en cada tubo.

Vectores de clonación

• Bacteriófago: Virus que infecta a las bacterias.
• Cósmidos: Vectores híbridos construidos con parte del cromosoma del fago y parte de un plásmido bacteriano.
• Fagémidos: Vectores híbridos compuestos por un plásmido al que se le inserta el origen de replicación de un fago M113.
• Cromosomas artificiales: Vectores de clonación con capacidad de transportar fragmentos de gran tamaño, idóneos para la construcción de genotecas.
• Vectores lanzadera: Vectores híbridos que contienen el origen de replicación de 2 hospedadores diferentes: un plásmido bacteriano y una levadura o virus animal.

PCR y cuantificación

• Ct: Ciclo de PCR donde la fluorescencia de la muestra alcanza un valor por encima del límite de detección. A menor Ct, mayor cantidad de ADN.
• Cuantificación absoluta: Expresar el resultado final en unidades de concentración o en número de copias por unidad de volumen.
• Cuantificación relativa: Expresar la concentración de la secuencia diana en relación con la concentración de referencia.

Proceso de clonación molecular

1. Inserción del fragmento de ADN que se amplifica en un vector de clonación o molécula portadora.
2. Introducción del vector recombinante en una célula viva hospedadora.
3. Selección y crecimiento en cultivo de células que portan el ADN recombinante.
4. Recuperación del fragmento amplificado.