Separación de Moléculas por Cromatografía de Intercambio Iónico: Fundamentos y Aplicaciones

Cromatografía de Intercambio Iónico

La cromatografía de intercambio iónico es un método que permite la separación de moléculas en función de sus propiedades de carga eléctrica. Se compone de dos fases: la fase estacionaria o intercambiador iónico y la fase móvil. La fase estacionaria, que es insoluble, lleva en su superficie cargas electrostáticas fijas que retienen contraiones móviles. Estos contraiones pueden intercambiarse por iones de la fase móvil. La fase móvil en la cromatografía de intercambio iónico suele ser una disolución acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgánico miscible con agua que contiene especies iónicas, generalmente en forma de buffer. Los iones de la fase móvil compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria.

El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que las moléculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible, de modo que dichas moléculas pueden ser unidas o separadas cambiando el ambiente iónico. La separación mediante intercambiadores iónicos se realiza, por lo general, en dos fases: en la primera, las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unión fuerte y estable; a continuación, se eluyen de la columna con tampones de diferente pH o diferente fuerza iónica, compitiendo los componentes del tampón con el material por los sitios de unión.

• (A) Con una fase estacionaria cargada negativamente, son retenidas las sustancias cargadas positivamente.
• (B) Deben competir con los contraiones (del amortiguador).
• (C) Las sustancias cargadas negativamente pasan a través de la fase estacionaria sin enlazarse.

Propiedades de los Intercambiadores Iónicos

Un intercambiador iónico es, por lo general, un polímero que tiene grupos cargados unidos. Si un grupo está cargado negativamente, podrá intercambiar iones positivos y será un intercambiador de cationes o catiónico. Un grupo típico que se utiliza en los intercambiadores de cationes es el grupo sulfónico, SO₃^-. Si se une un H⁺ al grupo, se dice que el intercambiador se encuentra en forma ácida, y puede, por ejemplo, intercambiar un H⁺ por un Na⁺ o dos H⁺ por un Ca²⁺. El grupo ácido sulfónico es un intercambiador de cationes fuertemente ácido. Otros grupos de utilización corriente son el carbonilo e hidroxilo fenólico, dos intercambiadores catiónicos débilmente ácidos. Si el grupo cargado es positivo (por ejemplo, un grupo amino cuaternario), es un intercambiador de aniones o aniónico fuertemente básico. Los intercambiadores aniónicos débilmente básicos más corrientes son grupos aminos alifáticos o aromáticos.

Estructuras de Resinas Intercambiadoras de Cationes

• (A) Resina de poliestireno, ácido fuerte (Dowex-50).
• (B) Resina de carboximetil celulosa, ácido débil (CM Cellulose).
• (C) Resina de poliestireno, ácido débil y quelante (Chelex-100).

Estructuras de Resinas Intercambiadoras de Aniones

• (A) Resina de poliestireno, base fuerte (Dowex- 1).
• (B) Resina de dietilaminoetil celulosa, ácido débil (DEAE).

Para una correcta elección de la porosidad y del tamaño de la malla, es necesario tener en cuenta que las moléculas pequeñas se separan mejor sobre matrices con tamaño de poro pequeño (o sea, un elevado grado de entrecruzamientos) debido a que la capacidad disponible es grande, mientras que las macromoléculas necesitan un tamaño de poro mayor.

Los intercambiadores de celulosa han probado ser los mejores para la purificación de moléculas grandes como proteínas y polinucleótidos. Esto se debe a que la matriz es fibrosa, por lo que todos los grupos funcionales se encuentran en la superficie y disponibles, incluso, para las moléculas mayores.