Sondas de Ácidos Nucleicos: Tipos, Marcaje y Procesos de Hibridación Molecular

Sondas de ADN

Según el proceso de obtención, las sondas de ADN pueden clasificarse de la siguiente manera:

• Síntesis química: Se obtienen anclando el primer nucleótido de la secuencia a una fase sólida y añadiendo nucleótido a nucleótido. Se caracterizan por ser monocatenarias y tener un tamaño reducido. Su principal ventaja es que, al ser monocatenarias, no requieren desnaturalización, y su tamaño reducido les permite una mejor penetración.
• ADN recombinante:
  1. El fragmento de ADN que queremos emplear como sonda se inserta en un vector de plásmido.
  2. El plásmido se introduce en una bacteria y se cultiva en un medio apropiado.
  3. Se extrae el plásmido amplificado y se emplea entero como sonda. Se caracteriza por ser bicatenaria y poseer un gran tamaño y alta sensibilidad.
• PCR: La obtención de sondas se realiza mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Se caracteriza por ser bicatenaria y tener un tamaño intermedio.

Sondas de ARN

Conocidas también como ribosondas, son siempre monocatenarias. Los híbridos ADN/ARN son más estables que los de ADN/ADN; sin embargo, presentan como inconveniente que son muy sensibles a cualquier contaminación. Según el proceso de obtención, las sondas de ARN pueden ser:

• De síntesis química: Se obtienen de forma análoga a las de ADN y presentan las mismas características generales.
• Transcripción: Se obtienen al transcribir desde un vector que contiene el fragmento de interés o mediante el uso de una ARN polimerasa.

El Marcaje de las Sondas

El marcaje de las sondas es el procedimiento de señalizar las sondas utilizadas en las técnicas de hibridación con la finalidad de poder visualizar los resultados. Existen diferentes tipos de marcadores:

• Isótopos radiactivos: Son elementos químicos con capacidad de emitir radiaciones. Los más utilizados son el fósforo-32 y el tritio. Se emplean principalmente en técnicas de hibridación en filtro. La detección del híbrido se realiza mediante rayos X.
• Fluorocromos: Son compuestos químicos que emiten luz al ser excitados por la luz ultravioleta. Se utilizan principalmente en la técnica FISH (Hibridación in situ fluorescente).
• Haptenos: Son moléculas de pequeño tamaño que se pueden acoplar a los nucleótidos sin alterar la especificidad de la sonda. Se pueden detectar mediante métodos inmunológicos.

Métodos de Marcaje

Desplazamiento de mella (Nick Translation)

Se utiliza para marcar sondas de ADN bicatenario de gran tamaño. El procedimiento consiste en incubar una determinada cantidad de sonda con una mezcla de reacción que contiene los siguientes elementos:

1. La ADNasa: En presencia de cationes magnesio, rompe los enlaces fosfodiéster entre dos nucleótidos consecutivos.
2. La ADN polimerasa: Gracias a su actividad exonucleasa 5’-3’ y su actividad polimerasa 5’-3’, va incorporando desoxirribonucleótidos marcados en el extremo 3’.

Cebador al azar o cebado aleatorio (Random Priming)

Se suele usar para marcar sondas de ADN bicatenario de gran tamaño. En este caso, la sonda se incuba con los siguientes reactivos: una mezcla de oligonucleótidos de 6 bases (hexámeros), el fragmento Klenow de la ADN polimerasa y una mezcla de desoxirribonucleótidos (uno de ellos marcado). La reacción de marcaje se produce en varias fases:

1. Desnaturalización de la sonda.
2. Unión de los hexámeros al azar.
3. Los hexámeros actúan como cebadores para que actúe la ADN polimerasa.

Fase de Hibridación

Todas las técnicas de hibridación se pueden dividir en dos etapas principales:

1. Fase de prehibridación: Es la fase de preparación de la muestra y el soporte. Se puede desarrollar en múltiples pasos que incluyen digestiones enzimáticas, electroforesis, entre otros.
2. Fase de hibridación: En esta etapa se produce la formación del híbrido sonda/secuencia diana. Factores críticos en esta fase son:
   • La Tm del híbrido: La mayor eficiencia se consigue a temperaturas situadas entre Tm - 32ºC y Tm - 16ºC.
   • Condiciones de astringencia: Se realiza en condiciones relajadas para facilitar la formación y estabilidad del híbrido, lo cual implica una alta concentración de cationes monovalentes y una baja concentración de formamida.