Southern Blot y Northern Blot: Técnicas de Biología Molecular

Southern Blot

Permite identificar fragmentos de ADN que han sido separados por electroforesis en gel y han sido transferidos a una membrana.

Protocolo del Southern Blot

Digestión Enzimática

Se utilizan enzimas de restricción para fragmentar el ADN.

Electroforesis en Gel

El ADN fragmentado sufrirá la separación por electroforesis en gel. Se utiliza un agente intercalante fluorescente, como el bromuro de etidio, para visualizar las bandas de ADN. Estas fotografías permiten comparar el patrón de bandas obtenido tras la digestión con el patrón de bandas obtenido en la hibridación.

Transferencia del ADN a la Membrana

Se crea una réplica exacta del patrón de bandas obtenido en el gel de electroforesis en una membrana de nitrocelulosa o nailon.

Desnaturalización: El ADN de doble cadena debe ser desnaturalizado para que pueda hibridar con la sonda.

Transferencia: Se realiza por capilaridad. Se coloca la membrana sobre el gel y se cubre con papel absorbente y un peso. El buffer sube por capilaridad, arrastrando el ADN del gel a la membrana.

Anclaje del ADN a la membrana: Se consigue incubando la membrana a 80ºC o irradiando con luz UV en el caso de las membranas de nailon.

Hibridación

Se realiza una prehibridación con ADN Carrier para bloquear los sitios de unión inespecíficos en la membrana. La hibridación se realiza incubando la membrana con los distintos reactivos (en un horno o baño hermético) a la temperatura adecuada y en agitación. Se utiliza una sonda o sondas específicas marcadas y diluidas en la solución de hibridación. La temperatura de hibridación (Tm) debe ser óptima para la sonda utilizada. Finalmente, se realizan lavados de poshibridación para eliminar la sonda no unida.

Revelado

Se realiza una autorradiografía con película de rayos X. Al comparar la película con la imagen del gel, se puede identificar la secuencia diana en un fragmento de un tamaño específico de entre la mezcla compleja de fragmentos generados por la digestión.

Aplicaciones del Southern Blot

• Elaboración de huellas genéticas
• Estudio de mutaciones estructurales (traslocaciones, deleciones, inserciones, inversiones)
• Detección de secuencias adquiridas

Northern Blot

Permite identificar moléculas de ARN.

Protocolo del Northern Blot

Se parte de ARN purificado y se procede igual que en el caso del Southern blot salvo por estas tres diferencias:

• No necesita una previa digestión enzimática.
• La electroforesis se realiza en condiciones desnaturalizantes, ya que el ARN tiende a aparearse de forma intramolecular.
• No se necesita desnaturalizar el ARN antes de la transferencia, ya que se encuentra en forma monocatenaria.

Aplicaciones del Northern Blot

• Análisis de expresión génica
• Detección de mutaciones
• Estudio de corte y empalme o splicing alternativos del ARNm