Técnicas de Aglutinación, Precipitación y Fijación del Complemento en Inmunología

1. Técnicas de Aglutinación

Las reacciones de aglutinación consisten en el agrupamiento de una suspensión de partículas debido a la reacción entre un antígeno (Ag) presente en las partículas (aglutinógeno) y un anticuerpo (Ac) específico (aglutinina). Se pone de manifiesto mediante la formación de aglutinados de partículas que portan en su superficie los Ag. Estas partículas pueden ser vitales (hematíes, bacterias…) o inertes (carbón vegetal, látex). Si la partícula es un hematíe, se denomina reacción de hemaglutinación. Los Ag son parte de la propia partícula o se han adherido de forma artificial.

Las partículas tienen numerosas moléculas de Ag y, estos deben tener múltiples determinantes antigénicos o epítopos presentes en la partícula de forma apreciable y situados superficialmente. Las inmunoglobulinas (Ig) más eficaces para la aglutinación son las IgM (multivalencia).

Para que la reacción de aglutinación se produzca, la concentración del aglutinógeno (Ag) no debe ser excesiva con respecto a la de la aglutinina (Ac) y viceversa. En caso contrario, se verificará el llamado fenómeno de zona y se obtendrá un resultado falsamente negativo. Otro factor importante es la temperatura. La mayoría de estas reacciones se realizan a temperatura ambiente, pero los aglutinógenos bacterianos suelen reaccionar mejor a 37ºC, e incluso algunas aglutininas a 4ºC.

1.1 Tipos de Aglutinación

• Directa: Consiste en provocar la aglutinación de corpúsculos naturales, como los hematíes, mediante la reacción con Ac frente a los Ag de superficie propios de esas partículas. Tras esta reacción se forma una especie de puente de unión entre las células, produciéndose la aglutinación. Esta técnica se emplea, por ejemplo, en la identificación de grupos sanguíneos y Rh.
• Indirecta: Consiste en provocar la aglutinación de corpúsculos (vitales o inertes) artificialmente recubiertos con Ag mediante la reacción con Ac frente a los Ag con los que se han recubierto los corpúsculos. Al proceso mediante el cual las partículas son recubiertas con aglutinógenos o antígenos que no les son propios se les denomina sensibilización.
• Indirecta inversa: Clase especial de prueba de aglutinación llamada inversa, en la que el aglutinógeno está libre en la muestra problema y reacciona con la aglutinina que está fijada a la superficie de la partícula. Últimamente recibe el nombre de coaglutinación. Un ejemplo de su aplicación es en la detección de la hepatitis B.

1.2 Valoración de la Aglutinación

Ventajas: Permite detectar una gran cantidad de Ag.

Inconveniente: Es difícil de cuantificar, es decir, determinar la concentración de la sustancia. Es un procedimiento cualitativo, nunca cuantitativo.

Sin embargo, podemos hacer una valoración semicuantitativa de los resultados de dos maneras:

1. Valoración subjetiva de la cantidad de agregados: Asignando más o menos cruces según el aspecto observado. Desde cuatro cruces (++++) para aglutinados muy gruesos, hasta una cruz (+) para aglutinados muy pequeños. A veces, los aglutinados son tan pequeños que solo se observan al microscopio, en este caso se considera un positivo débil.
2. Titulación mediante diluciones seriadas: Se preparan diluciones seriadas de la muestra problema y se practica el ensayo de aglutinación con cada una de las diluciones preparadas. Se llama título de la prueba a la inversa de la máxima dilución con la que la reacción ha dado positiva. La unidad mínima detectable (U.M.D) o sensibilidad mínima es la cantidad mínima de sustancia problema que es capaz de detectar la prueba utilizada para hacer la determinación. Multiplicando el título por la UMD se calcula, de una forma aproximada, la concentración de la sustancia investigada en la muestra problema (Tasa): concentración o tasa: título x UMD

1.3 Otras Pruebas de Aglutinación

1. Reacciones de Inhibición de la Aglutinación

En este caso, la aglutinación (+) indica ausencia de la sustancia a estudiar y, por tanto, la prueba es negativa. Por otro lado, la aglutinación (-) indica presencia de esta y la prueba es positiva. Es decir, la existencia de aglutinación indica la ausencia de antígenos en la muestra.

2. Test de Coombs

La antiglobulina humana o reactivo de Coombs es un Ac producido contra el fragmento Fc de la IgG humana. El test de Coombs se ha desarrollado para la detección de Ac incompletos frente a los Ag de los hematíes. Estos Ac, aunque reaccionan con los Ag eritrocitarios, no son capaces de producir aglutinación; para provocarla se añade antiglobulina humana que reacciona con los Ac unidos a los Ag de los hematíes, produciéndose así la aglutinación.

Existen dos variantes:

• Directa: Permite la detección de Ac unidos a los eritrocitos. Entre sus aplicaciones está el diagnóstico de anemias autoinmunes o de anemia hemolítica en un recién nacido Rh+ hijo de una madre Rh-.
• Indirecta: Permite la detección de Ig anti-Rh en el suero materno. Se incuba el suero problema con hematíes Rh+, si hay Ig anti-Rh se unirá a estos hematíes y al añadir el reactivo de Coombs se producirá la aglutinación de los hematíes. También se utiliza para detectar algunos grupos sanguíneos como el antígeno Duffy.

2. Técnicas de Precipitación

Se utilizan Ag solubles que se difunden frente a los Ac. La unión Ag-Ac precipita de forma visible y permite establecer la presencia de Ac específicos. A medida que los Ac se van uniendo a los determinantes antigénicos de distintas moléculas de Ag se forman complejos inmunes cada vez más grandes e insolubles.

La diferencia entre precipitación y aglutinación es el estado de dispersión del Ag:

1. Precipitación: Las moléculas de Ag están libres en la disolución.
2. Aglutinación: El Ag está fijado a la superficie de la partícula.

Esta diferencia hace que la sensibilidad de la reacción para la determinación de Ac sea mucho mayor en la aglutinación.

2.1 Factores que Influyen en las Reacciones de Inmunoprecipitación

1. Concentración del Ag y del Ac: La precipitación de complejos inmunes solo ocurre cuando las concentraciones de Ag y Ac son equivalentes (1 molécula de Ag por 3 o 4 de Ac, a esta situación se la conoce como punto de equivalencia). Si hay un exceso de Ac, se produce el fenómeno prozona. Si hay un exceso de Ag, se produce el fenómeno postzona.
2. Temperatura: El precipitado se puede formar bien en un amplio rango de temperaturas, aunque algunos Ac presentan mayor reactividad a determinada temperatura.
3. pH: Los complejos inmunes se forman mejor a pH neutro, entre 6 y 7,5.
4. Concentración de sales del medio: A mayor concentración de sales, los complejos son más solubles y, por lo tanto, más difíciles de precipitar.
5. Carga de los inmunocomplejos: Los inmunocomplejos excesivamente cargados son difíciles de precipitar.
6. Afinidad (con una interacción única) y avidez (fuerza de interacción de todos los ligandos): A mayor afinidad y avidez del Ac por el Ag, más rápidamente se produce la reacción de inmunoprecipitación y más estable es el precipitado formado.

2.2 Técnicas de Inmunodifusión

• Inmunodifusión radial simple o de Mancini
• Inmunodifusión simple en tubo de Oudin
• Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony
• Inmunoelectroforesis
• Inmunofijación
• Contrainmunoforesis (CIEF)
• Electroinmunodifusión

3. Técnicas de Fijación del Complemento (RFC)

La capacidad de unión de los componentes del sistema del complemento a los complejos Ag-Ac se denomina fijación del complemento. Esta técnica permite evaluar:

• La actividad de las proteínas del sistema del complemento
• Determinar los niveles de Ag o Ac en el suero del paciente

La prueba de fijación del complemento necesita varias etapas y al menos 48 horas para obtener resultados. Es necesario la unión previa del Ag-Ac. No todos los Ac son capaces de activar la secuencia del complemento, siendo la IgM la molécula más eficaz para hacerlo debido a su estructura pentamérica.

Todas las técnicas de fijación del complemento utilizan:

• Un sistema de prueba
• Un sistema indicador

Cuando estos tres componentes se mezclan en condiciones óptimas, los anticuerpos antieritrocitarios de carnero se unirán a la superficie de los eritrocitos y el complemento se unirá después al complejo antígeno-anticuerpo. El anticuerpo eritrocitario de carnero también se denomina hemolisina porque rompe los hematíes y libera hemoglobina.

3.1 Tipos de Reacción de Fijación del Complemento (RFC)

1. Técnica de una etapa: Permite cuantificar el nivel total del sistema de complemento o cada uno de sus componentes por separado. Se mezcla un volumen conocido de hematíes de carnero que actúan como Ag con un volumen conocido de Ac antihematíes de carnero denominados hemolisina, este es un “sistema indicador” que produce lisis y lo denominamos “sistema lítico”.
2. Técnica de dos etapas: Se utiliza para medir la concentración de Ag o Ac presente en el suero problema. En una primera etapa se hace reaccionar el Ag con su correspondiente Ac en presencia de una cantidad conocida del complemento, así si existe el Ag o el Ac buscado en el suero problema, se formarán los complejos Ag-Ac a los que se fijará el complemento. En una segunda etapa se añade una suspensión de hematíes de carneros sensibilizados con hemolisina y el complemento sobrante de la primera reacción dará lugar a la hemólisis de los hematíes, pero en este caso la hemoglobina liberada será inversamente proporcional a la cantidad de Ag o Ac presentes en la muestra problema. Un resultado positivo significa que el paciente posee anticuerpos fijadores de complemento y se manifiesta por la ausencia de lisis de eritrocitos en el sistema final. La lisis del indicador indica ausencia de anticuerpos y una prueba de FC negativa.