Técnicas de Análisis Molecular: Northern Blot y Microarrays

NORTHERN BLOT

Permite detectar ARN.

Consiste en extraer el ARN de las células y su posterior separación por tamaño mediante electroforesis en gel.

Las muestras de ARN son separadas en geles de agarosa que contienen formaldehído como agente desnaturalizante. Esto se debe a que, a pesar de ser una molécula de una sola cadena, el ARN puede formar complejas estructuras secundarias.

Los geles pueden ser teñidos con bromuro de etidio y visualizados bajo luz UV.

Las moléculas de ARN son transferidas y unidas a un filtro. Después de la hibridación, y posterior a la detección mediante algún método de marcaje, las bandas en el gel indican la ubicación de los tipos de ARN que son complementarios a la sonda utilizada.

Teniendo marcadores de ARN de tamaño adecuado, se puede conocer el tamaño de los ARN que se han identificado. La técnica permite conocer el tamaño preciso de un ARN mensajero (ARNm).

Además, el Northern Blot sirve para identificar diferentes tipos de ARN mensajero codificados por un mismo gen y para determinar la cantidad y el tejido específico en que se encuentra un ARNm.

Una limitación importante del Northern Blot es que el ARN se degrada fácilmente. Esto obliga a que todas las manipulaciones se realicen de forma rápida y evitando el contacto de la muestra con ARNasas.

MICROARRAY

Los microarrays se utilizan para la determinación y cuantificación de ADN en una muestra.

Su principal ventaja es la alta densidad de integración de material biológico que se consigue inmovilizar, lo que permite analizar simultáneamente miles de genes.

Aplicaciones de los Microarrays:

• Análisis de expresión génica
• Detección de mutaciones y polimorfismos
• Secuenciación

Un microarray de ADN consiste en un gran número de moléculas de ADN ordenadas sobre un sustrato sólido, de manera que formen una matriz de secuencias en dos dimensiones.

Estos fragmentos pueden ser:

• Secuencias cortas: oligonucleótidos
• De mayor tamaño: ADN complementario (ADNc)
• Productos de PCR

A estos fragmentos de ADN de una sola hebra se les denomina sondas.

Los ácidos nucleicos se marcan por diversos métodos y se incuban sobre el panel de sondas, permitiendo la identificación y cuantificación del ADN.

La miniaturización permite el anclaje, en pocos centímetros, de cientos de spots alineados en filas y columnas, cada uno de los cuales se corresponde a una secuencia específica de ADN.

Se obtiene un "puzle" en el que la lectura permite identificar la presencia o ausencia de los diferentes fragmentos, y componen un cuadro genómico, o huella genética. La identificación puede precisar de la ayuda de algoritmos y programas informáticos.

Esta técnica sirve para el estudio del ADN, de proteínas e hidratos de carbono.

Los microarrays permiten:

• Medir la expresión de genes (ej.: en un tumor)
• Estudiar la mutación de un gen (ej.: en una enfermedad hereditaria)
• Desarrollar arrays de hibridación genómica o aCGH

Su máxima utilidad se encuentra en el campo del diagnóstico clínico, de la proteómica y de la farmagenómica.