Técnicas Avanzadas de Biología Molecular y Diagnóstico Genético

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La PCR es una técnica que consiste en amplificar moléculas de ADN, creando una cantidad enorme de copias en poco tiempo. Gracias a este proceso, se pueden estudiar muestras que cuentan con muy poco material genético disponible.

Ventajas y Desventajas

• Ventajas: Presenta una gran sensibilidad, pudiendo realizarse incluso con muestras mínimas de ácidos nucleicos.
• Desventaja: Existe una gran facilidad para obtener falsos positivos debido a la mínima contaminación de la muestra. Cabe destacar que es una técnica cualitativa.

Reactivos Principales

Para llevar a cabo la reacción se requieren los siguientes componentes:

• Cebadores (primers).
• ADN polimerasa.
• Nucleótidos para que la enzima los incorpore al nuevo ADN.
• Cloruro de magnesio.
• Un buffer (tampón).
• Agua libre de ADNasas y ARNasas.

Funcionamiento del Termociclador

El termociclador es el equipo encargado de calentar la muestra hasta la temperatura apropiada, permitiendo la separación de las hebras de ADN para que queden accesibles a los cebadores. Una vez producida la replicación, el dispositivo enfría la muestra para que las hebras vuelvan a juntarse, regresando a su estado original.

Etapas de la PCR

1. Desnaturalización: Se realiza a 95 °C durante un periodo de 1 a 5 minutos.
2. Apareamiento: Unión con los cebadores a una temperatura de entre 50 y 70 °C.
3. Elongación: Llevada a cabo por la ADN polimerasa (Taq polimerasa a 72 °C).
4. ADN replicado: Obtención del producto final.

Técnicas de Hibridación con Sonda

Estas técnicas emplean una secuencia de material genético, marcada específicamente para ser identificada, que se une al ADN o ARN para estudiar regiones específicas del mismo. Se utiliza para determinar la presencia o ausencia de regiones de ácidos nucleicos en estudios de patologías genéticas y enfermedades infecciosas.

Tipos de Sondas

Una sonda es un fragmento de ácido nucleico marcado con una sustancia que permite su detección posterior al unirse al ácido nucleico de interés. Se clasifican en:

• Sondas de ADN: Obtenidas a partir de la clonación de ADN; son bicatenarias.
• Sondas de ARN: Generadas al transcribir una molécula de ADN clonado; son monocatenarias.
• Sondas de oligonucleótidos: Fragmentos de ADN monocatenario que poseen entre 15 y 50 nucleótidos.

Métodos de Transferencia: Southern Blot y Northern Blot

Southern Blot

En esta técnica se extrae el ADN, se fragmenta mediante la acción de enzimas y se somete a una electroforesis. Con la ayuda de HCl y NaOH, se desnaturaliza el ADN y se transfiere a un soporte sólido. Este soporte se incuba con la sonda marcada, se lava el exceso no unido y se procede a la detección final.

Northern Blot

Esta variante se utiliza para el estudio del ARN. El material se extrae y se separa mediante electroforesis. Al igual que en el método anterior, se transfiere el ARN a un soporte sólido para su fijación e hibridación con la sonda marcada. Tras lavar la sonda no unida, se realiza la detección.

ADN Ligasa y Secuenciación de Segunda Generación

ADN Ligasa

Estas enzimas son las encargadas de unir los fragmentos de ADN que han sido separados previamente por las enzimas de restricción. Para que esto ocurra, debe existir complementariedad de bases en los bordes cohesivos que se van a unir.

Secuenciación Masiva (NGS)

Los métodos de segunda generación se conocen como secuenciación masiva o NGS (Next Generation Sequencing). El proceso consta de tres fases fundamentales:

1. Preparación del ADN a secuenciar (molde).
2. Secuenciación propiamente dicha.
3. Análisis de los datos obtenidos.

Dentro de la fase de secuenciación, destacan dos reacciones principales: la terminación reversible cíclica y la pirosecuenciación. Ambas se caracterizan por ser cíclicas, no electroforéticas y basarse en la detección de fluorescencia o luminiscencia.

Aplicaciones en Farmacogenómica

• Farmacogenómica: Disciplina que estudia el impacto del genoma completo sobre la respuesta del organismo a los fármacos.
• Farmacogenética: Estudio de la relación específica entre un gen determinado y la respuesta a un medicamento.