Técnicas de Biología Molecular: PCR, Clonación y Ensayos Inmunológicos

Técnicas de Biología Molecular

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) es una técnica que permite multiplicar moléculas de ADN hasta 100.000 veces in vitro, proporcionando grandes cantidades de genes específicos para su clonación, secuenciación o mutagénesis. Se basa en la actividad de la enzima ADN polimerasa, que es capaz de fabricar una cadena de ADN complementaria a otra ya existente. Sus requerimientos son:

• Nucleótidos
• Una cadena de ADN molde que se pueda unir a la molécula que queremos copiar

Etapas de la PCR:

1. Desnaturalización: Calentamiento a 95°C para separar las dos hebras de ADN mediante incubación breve.
2. Hibridación: Enfriamiento rápido y acoplamiento de los cebadores a las cadenas de ADN.
3. Elongación: Etapa de amplificación, donde la ADN polimerasa termoestable elonga los cebadores, sintetizando nuevas cadenas de ADN.

Selección del Clon Idóneo

Al introducir ADN foráneo en una célula hospedadora, pueden ocurrir tres situaciones:

• Solo se introduce el vector.
• Se introduce el vector con el ADN foráneo.
• El ADN foráneo se recirculariza.

Para seleccionar el clon que contiene el ADN foráneo de interés, se pueden utilizar diferentes técnicas:

Técnicas de Selección de Clones:

1. Inactivación insercional: Se introduce el ADN foráneo en un gen marcador del vector, de forma que este gen se inactive. Las colonias que no expresen el marcador contendrán el inserto.
2. Inserción génica positiva: Al ADN foráneo se le une un marcador. Las colonias con el inserto presentarán las características del marcador.
3. Hibridación de colonias: Se detectan secuencias de ADN en colonias transformadas mediante hibridación in situ con sondas marcadas.

Ensayos Inmunológicos

Reacción de Aglutinación

La reacción de aglutinación es un agrupamiento visible formado por la interacción entre un anticuerpo y un antígeno. Los anticuerpos que participan en esta reacción se llaman "aglutininas".

Radioinmunoensayo (RIA)

El radioinmunoensayo se basa en la unión de un antígeno radiomarcado y un antígeno no marcado a un anticuerpo de alta afinidad. La cantidad de antígeno no marcado se puede determinar midiendo la cantidad de radioactividad asociada al anticuerpo.

Ensayos de Inmunoabsorción

En los ensayos de inmunoabsorción, una enzima conjugada con un anticuerpo reacciona con un sustrato incoloro para generar un producto coloreado. La intensidad del color es proporcional a la cantidad de antígeno presente.

Inmunoprecipitación

La inmunoprecipitación consiste en mezclar una muestra de células que contiene el antígeno con el anticuerpo específico. El complejo antígeno-anticuerpo precipita, lo que permite separar el antígeno del resto de la muestra.

Inmunofluorescencia

La inmunofluorescencia se basa en el uso de moléculas fluorescentes que absorben luz de una longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda. Los anticuerpos se marcan con estas moléculas y se utilizan para detectar la presencia de antígenos en una muestra.

Anticuerpo

Los anticuerpos son glucoproteínas producidas por el organismo para actuar contra un antígeno. Cada anticuerpo es específico para un antígeno determinado.

Inmunoensayo

Un inmunoensayo es una prueba que utiliza anticuerpos y antígenos como medio para generar un resultado perceptible. Existen diferentes tipos de inmunoensayos, como los descritos anteriormente.