Técnicas Citogenéticas: Bandeo G, Cariotipo Humano y Diagnóstico Prenatal

Pasos del Bandeo G

El bandeo G es una de las técnicas más empleadas en citogenética para la identificación cromosómica. Consta de las siguientes fases:

• Digestión con tripsina: se realiza por inmersión de las preparaciones en una solución de tripsina durante un tiempo que dependerá de la concentración de la enzima, la temperatura de incubación y el grado de envejecimiento de la preparación. La digestión se detiene mediante lavados con solución salina o PBS.
• Tinción con Giemsa: se efectúa por inmersión en solución tamponada de Giemsa. Posteriormente, las preparaciones se lavan con agua y se dejan secar.

Procedimiento

1. Sumergir las preparaciones envejecidas en solución con tripsina al 0,1 % en PBS durante 5-10 segundos.
2. Lavar dos veces en PBS.
3. Sumergir las preparaciones en solución de Giemsa al 3 % en tampón fosfato a pH 6,7 durante 5 minutos.
4. Lavar con agua y dejar secar.

Estudio Cromosómico

Permite obtener el cariotipo, facilitando la detección de alteraciones cromosómicas tanto numéricas como estructurales.

Recuento y Estudio de Metafases Completas

Para confeccionar un cariotipo se evalúa un mínimo de 20 metafases completas. Estas metafases se observan al microscopio y se realiza el recuento cromosómico; al menos 5 de ellas se fotografían. Las metafases fotografiadas se someten a una evaluación minuciosa, comparando cada cromosoma con su homólogo banda a banda para identificar cualquier cambio estructural.

Ordenamiento y Emparejamiento: Características Morfológicas de los Cromosomas Humanos

La clasificación cromosómica se basa en los siguientes criterios:

• Tamaño: ordenados de mayor a menor longitud.
• Posición del centrómero: primero se disponen los metacéntricos, luego los submetacéntricos y finalmente los acrocéntricos.
• Presencia de constricciones secundarias: los cromosomas se agrupan en 8 conjuntos (7 autosómicos y 1 sexual):
  • Grupo A: cromosomas 1, 2 y 3 (los más grandes). Los cromosomas 1 y 3 son metacéntricos, mientras que el 2 es submetacéntrico.
  • Grupo B: cromosomas 4 y 5 (grandes y submetacéntricos).
  • Grupo C: cromosomas del 6 al 12 (submetacéntricos de tamaño mediano).
  • Grupo D: cromosomas 13, 14 y 15 (acrocéntricos de tamaño mediano-grande con constricción secundaria y satélites).
  • Grupo E: cromosomas 16, 17 y 18 (submetacéntricos pequeños).
  • Grupo F: cromosomas 19 y 20 (metacéntricos pequeños).
  • Grupo G: cromosomas 21 y 22 (los acrocéntricos más pequeños del cariotipo humano, con constricción secundaria y satélites).
  • Cromosomas sexuales: cromosoma X (submetacéntrico mediano, similar al grupo C) y cromosoma Y (acrocéntrico pequeño, semejante al grupo G).

Patrón de Bandas G

Las bandas G son las más utilizadas en citogenética para el estudio cromosómico, ya que permiten la identificación inequívoca de cada cromosoma; esto resulta fundamental en el grupo C debido a su marcada homogeneidad morfológica. Asimismo, facilitan la detección y evaluación de alteraciones estructurales. El patrón depende del grado de condensación cromosómica, situándose el estándar habitual en 350-400 bandas por dotación haploide.

Nomenclatura Citogenética y Fórmula Cromosómica

La fórmula cromosómica proporciona una descripción estandarizada y detallada del cariotipo según las normas internacionales (ISCN):

• Sin anomalías: se inicia indicando el número total de cromosomas del individuo seguido de una coma. A continuación, se especifican los cromosomas sexuales (por ejemplo, 46,XX o 46,XY).
• Anomalías numéricas: se definen indicando el número total seguido de los gonosomas y la alteración. Ejemplos en cromosomas sexuales: 45,X (monosomía del cromosoma X) o 47,XYY (disomía del cromosoma Y). Si afecta a los autosomas, se detalla a continuación de los cromosomas sexuales: las monosomías se identifican con un signo menos (-) seguido del cromosoma ausente, y las trisomías con un signo más (+) precediendo al cromosoma supernumerario (ej. 47,XX,+21).
• Anomalías estructurales: se describen tras las anomalías numéricas o tras los cromosomas sexuales, separadas por una coma:
  • Alteraciones en un único cromosoma: se representan con la abreviatura de la anomalía, el número del cromosoma afectado entre paréntesis y las bandas implicadas también entre paréntesis.
  • Alteraciones en dos cromosomas: se coloca la abreviatura, los cromosomas implicados entre paréntesis separados por punto y coma, y los puntos de rotura y reunión en cada cromosoma, entre paréntesis y separados por punto y coma.
  • Inserciones/Translocaciones: para las inserciones se utiliza la abreviatura ins, especificando primero el cromosoma aceptor y posteriormente el donante.

Cariotipo de Alta Resolución

Se obtiene a partir de cromosomas sincronizados en profase tardía o prometafase. Dado que el nivel de condensación cromatínica es menor que en metafase, el bandeo G revela un número significativamente mayor de bandas (entre 550 y 850 bandas), lo que incrementa la sensibilidad para diagnosticar microdeleciones y reordenamientos estructurales crípticos.

Procedimiento

1. Preparar el cultivo de linfocitos de sangre periférica y efectuar la siembra siguiendo la metodología convencional.
2. Incubar a 37 °C con un 5 % de CO₂ durante 48-56 horas.
3. Añadir metotrexato (la concentración dependerá de la presentación y volumen del cultivo).
4. Incubar a 37 °C con un 5 % de CO₂ durante 5 a 5:30 horas.
5. Añadir 1 o 2 gotas de solución de colcemid (10 µg/ml).
6. Incubar a 37 °C durante 30 minutos adicionales.
7. Proceder a la detención y procesamiento del cultivo (choque hipotónico, fijación y extensión) según el protocolo estándar.

Cariotipo en Vellosidades Coriónicas

Las vellosidades coriónicas son proyecciones del corion, una envoltura embrionaria fundamental en el desarrollo placentario cuyas células comparten la misma dotación genética que el embrión.

Toma de Biopsia

La biopsia corial se realiza por vía transcervical o transabdominal mediante control ecográfico continuo entre las semanas 10 y 14 de gestación. En esta etapa, las vellosidades presentan un diámetro óptimo y un índice mitótico adecuado para la obtención de metafases de calidad. Ofrece la ventaja de posibilitar el diagnóstico prenatal temprano (primer trimestre), aunque plantea el inconveniente de eventuales discrepancias por mosaicismo confinado a la placenta o contaminación con tejido materno.

Lavado y Selección de la Muestra

Las muestras de biopsia se recolectan en tubos estériles con medio RPMI-1640 suplementado con antibióticos y heparina, medio en el cual pueden conservarse hasta 24 horas antes de su procesamiento, aunque se recomienda la manipulación inmediata.

El paso inicial crítico es el lavado y selección cuidadosa de la muestra con el fin de retirar decidua y sangre materna:

1. Transferir la biopsia a una placa de Petri con medio de cultivo o solución salina estéril.
2. Examinar minuciosamente cada una de las ramificaciones de las vellosidades bajo lupa estereoscópica.
3. Retirar restos de coágulos y fragmentos de origen materno utilizando agujas enmangadas estériles; ante cualquier duda sobre el origen del tejido, este debe descartarse.

Todo el instrumental debe encontrarse perfectamente estéril y todas las manipulaciones deben ejecutarse en cabinas de seguridad biológica para evitar contaminaciones exógenas.