Técnicas de Cromatografía: Separación por Filtración en Gel e Intercambio Iónico

Cromatografía en Columna

Es un método físico de separación, los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una en reposo (fase estacionaria) y una fase móvil que se mueve en una dirección definida. Las cromatografías en columna más utilizadas son la filtración en gel, de intercambio iónico y de afinidad.

1. Filtración en Gel (Cromatografía de Exclusión Molecular)

Permite separar moléculas en base a su tamaño. Principalmente para separar proteínas o ácidos nucleicos y para desalar macromoléculas. Los geles consisten en granos de un material poroso (polisacáridos), embebidos en un solvente acuoso.

Se aplica la muestra sobre el gel, se deja penetrar y posteriormente se hace pasar el solvente (eluyente). Los componentes cuyas moléculas no caben en los poros del gel pasan a través de los espacios que quedan entre los granos del gel y se dice que son excluidos. Los componentes de tamaño molecular menor pueden penetrar en los poros, y cuanto menor sea su tamaño, mayor será el volumen al cual tienen acceso. En conclusión, los componentes excluidos son eluidos (salen de la columna primero) y posteriormente los componentes incluidos (en orden de mayor a menor tamaño).

Los materiales utilizados se conocen por sus nombres comerciales: Sephadex, Bio-Gel, Sephacrilo. La principal diferencia entre materiales está en el rango de fraccionamiento. Los componentes de una muestra de PM mayor o menor al rango de fraccionamiento del gel de una columna no son separados por la columna.

2. Intercambio Iónico

Involucra principalmente la formación de uniones iónicas múltiples entre los grupos cargados de la proteína y los grupos disponibles de carga opuesta del gel.

• Partículas cargadas negativamente (-) se unen a la matriz sólida cargada positivamente (+) y son retenidas.
• Partículas cargadas positivamente (+) son rechazadas por la matriz sólida cargada positivamente (+) y son eluidas.
• La elución de las partículas cargadas negativamente (-) se consigue cambiando el pH del solvente hasta igualarlo a su punto isoeléctrico o hasta invertir su carga neta.

El intercambio de iones está formado por una matriz insoluble a la cual están unidos covalentemente grupos cargados. De acuerdo a la carga de estos grupos se distinguen:

• Intercambiadores de aniones: Los grupos poseen carga positiva (+). Se usan principalmente los grupos DEAE (dietil amino etilo) y QAE (amina cuaternaria).
• Intercambiadores de cationes: Los grupos poseen carga negativa (-). Se usan principalmente los grupos CM (carboxi metilo), fosfato y SP (sulfo propilo).

Las matrices más comunes son los Sephadex, Sepharosas y resinas sintéticas.

Involucra dos etapas:

1. Aplicación de la muestra y lavado con tampón: Los componentes de carga neta opuesta a la carga de los grupos del intercambiador son retenidos en la columna por atracción electrostática, los demás componentes no son retenidos.
2. Elución de los componentes retenidos: Se logra agregando una sal al tampón o cambiando el pH. En el primer caso se produce un desplazamiento de los componentes unidos por el correspondiente ion de la sal. Ejemplo: aniones cloruro desplazan a proteínas de carga neta negativa de una columna de un intercambiador de aniones, como DEAE-Sephadex.

Las proteínas de carga neta mayor están unidas más fuertemente y serán eluidas a una concentración de sal mayor que otras de menor carga neta.

En el segundo caso, se produce un cambio de la carga neta de las proteínas retenidas. Cuando la carga de una proteína desaparece o cambia de signo, la proteína eluye. La elución utiliza un gradiente escalonado o continuo. La purificación de un compuesto se logra mayoritariamente en la etapa de elución.

El resultado se expresa en forma del perfil de elución, un gráfico de la concentración de los solutos en función del volumen de eluato o del número de las fracciones colectadas. El volumen se comienza a medir a partir de la aplicación de la muestra.

La cantidad de proteínas que puede ser retenida por una columna de intercambio iónico depende del volumen del intercambiador y de su capacidad, expresada en mg de una proteína estándar que puede unir por ml.