Técnicas Esenciales en Biología Molecular: Extracción de ADN y PCR

Suspensiones Celulares

Las suspensiones celulares están formadas por células libres y mezclas de células que flotan dispersas en el seno de un medio líquido.

La Solución de Lisis

La solución de lisis es fundamental para liberar el contenido celular. Sus componentes principales son:

• Detergentes: Desestructuran la bicapa lipídica de las membranas y desnaturalizan las proteínas, de manera que la lisis celular libera el contenido citoplasmático y nuclear al medio.
• EDTA: Actúa como quelante de iones de calcio y magnesio.
• Proteasas: Digieren las proteínas de la membrana celular y eliminan las nucleasas.
• Agentes caotrópicos: Inactivan las nucleasas.

Extracción de Ácidos Nucleicos por Columna

El proceso de extracción de ácidos nucleicos mediante columnas de cromatografía sigue los siguientes pasos:

1. La columna de cromatografía se carga con una disolución del lisado. Los ácidos nucleicos se unen a los grupos funcionales del intercambiador, y el resto de componentes eluyen de la columna.
2. La columna se lava con una concentración salina creciente, eliminando los contaminantes débiles con carga negativa.
3. El ADN se separa de la columna con agua desionizada y cae al tubo Eppendorf.

Primers (Cebadores) en PCR

Los primers o cebadores son esenciales en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR):

• Se diseñan por parejas, y cada uno es complementario de una secuencia adyacente a la región de interés, pero en extremos y cadenas opuestas (Forward/Reverse).
• Un par de primers define y delimita la región diana de una molécula de ADN a amplificar.

La Mezcla de Reacción de PCR

La mezcla de reacción contiene todos los reactivos necesarios que deben estar en el medio para que la PCR se desencadene de forma adecuada:

• Mg²⁺ (Iones de Magnesio): Las ADN polimerasas requieren iones de magnesio como cofactor para desarrollar su actividad.
• dNTPs (Desoxinucleótidos Trifosfato):
  • Contienen los cuatro desoxinucleótidos que componen las moléculas de ADN en forma de dNTPs.
  • Deben estar presentes en la misma concentración.
• Primers (Cebadores): Claves para realizar una amplificación específica con éxito.
• Taq Polimerasa (o ADN Polimerasa): La elección de una u otra ADN polimerasa dependerá de la fidelidad de la amplificación, de la longitud del fragmento y de la secuencia a amplificar.
• ADN Molde: Contiene el fragmento a amplificar y se utiliza ADN purificado.

Variantes de PCR

PCR con Inicio Caliente (Hot Start PCR)

Es un tipo de PCR basado en eliminar la actividad de la enzima a bajas temperaturas para evitar la aparición de productos de amplificación inespecíficos, lo cual está relacionado con la hibridación inespecífica de los cebadores.

PCR para Grandes Fragmentos

Es una variante de la PCR estándar que permite aumentar el rendimiento cuando se amplifican fragmentos entre 5 y 35 kb (1 kb = 1000 bases).

PCR de Alta Fidelidad

PCR realizadas en condiciones especiales para evitar introducir mutaciones puntuales en las amplificaciones por incorporación de nucleótidos erróneos.