Técnicas de Extracción de ADN y Fundamentos de la PCR

Extracción de ADN

Definición: Aislamiento y purificación de moléculas de ADN basándose en sus características fisicoquímicas.

Métodos de extracción de ADN

• Kits comerciales: Utilizan matrices inorgánicas que retienen el ADN. El proceso es más rápido e incluye soluciones sin fenol, cloroformo ni etanol.
• Métodos tradicionales: Basados en la solubilidad del ADN; se utiliza alcohol para precipitar el ADN.

Etapas comunes:

• Colecta de muestra.
• Homogeneización y lisis celular.
• Precipitación.
• Lavado.
• Disolución y recuperación del ADN.
• Cuantificación mediante espectrofotometría (260 nm).

Selección de métodos de extracción

La elección depende del organismo, el tipo de tejido, el estado de conservación, la técnica posterior y el tiempo disponible.

Ventajas y desventajas

• Métodos tradicionales:
  • Ventajas: Bajo costo y alto rendimiento.
  • Desventajas: Material fragmentado y susceptibilidad a la contaminación.
• Métodos comerciales:
  • Ventajas: Alta pureza, menor número de pasos y reducción de la contaminación.
  • Desventajas: Mayor costo.

Almacenamiento y cuantificación del ADN

• Almacenamiento: A 4 °C para uso inmediato; a -20 °C o -80 °C para preservación a largo plazo.
• Uso de soluciones con baja concentración de sales para inhibir las DNasas.
• Cuantificación mediante espectrofotometría basada en la ley de Beer-Lambert.

Componentes del ADN

El ADN está compuesto por:

• Base nitrogenada.
• Azúcar desoxirribosa (ADN) o Ribosa (ARN). Ambos son azúcares pentosas.

Componentes básicos

• Nucleósidos: Azúcar + Base.
• Nucleótidos: Azúcar + Fosfato + Base.

Bases nitrogenadas

• Purinas: Tienen doble anillo o más (adenina y guanina).
• Pirimidinas: Un solo anillo (citosina, timina y uracilo).

Emparejamiento de bases:

• Adenina y Timina: Forman dos puentes de hidrógeno.
• Citosina y Guanina: Forman tres puentes de hidrógeno.

Nota: En el cuerpo, los enlaces de ADN no se rompen fácilmente por las enzimas.

ADN y ARN

Los ácidos nucleicos son hidrofílicos y tienen carga negativa a un pH de 7.

Bases estructurales de las reglas de Chargaff

• Las dos cadenas tienen sus secuencias complementarias.
• Existen dos operaciones lógicas para obtener la cadena complementaria de 5' a 3':
  1. Reversión: Reescribir la secuencia de atrás hacia adelante.
  2. Complementación: Intercambiar A con T y C con G.

Desnaturalización y renaturalización del ADN

• Las secuencias de ADN pueden renaturalizarse espontáneamente y formar hélices.
• Es la base de muchas técnicas de biología molecular como la PCR y la secuenciación de ADN.

Replicación Semiconservativa

Cada nueva cadena de ADN contiene una hebra original y una hebra nueva.

Estructuras locales de ADN

• Palíndromos (repeticiones invertidas).
• Repeticiones directas.
• Estructuras en horquilla y cruciformes.

Funciones de los nucleótidos

• Intermediarios energéticos.
• Cofactores enzimáticos.
• Moléculas reguladoras.

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Definición: Técnica usada para amplificar secuencias específicas de ADN.

Importancia: Permite la creación de millones de copias de una secuencia de ADN en un corto periodo de tiempo.

Historia de la PCR

• 1983: Kary Mullis desarrolla la PCR.
• 1985: Primera publicación de la PCR por Cetus Corporation.
• 1986-1991: Mejoras en la técnica y uso de la Taq polimerasa.
• 1993: Kary Mullis recibe el Premio Nobel por su invención.

Tipos de PCR

• RT-PCR: Usa ARN como plantilla para generar ADNc.
• PCR cuantitativa (qPCR): Permite cuantificar la cantidad de producto amplificado en tiempo real.
• PCR alelo específica: Detecta alelos específicos de un ADN.
• PCR asimétrica: Produce mayor cantidad de una sola hebra de ADN.
• PCR inversa: Amplifica secuencias de ADN de una región conocida.
• PCR múltiple: Amplifica múltiples secuencias simultáneamente.
• PCR anidada (Nested PCR): Incrementa la especificidad mediante varias rondas de amplificación.
• Touchdown PCR: Optimiza el emparejamiento de los cebadores en el mismo ciclo.
• PCR-RACE.

Flujo central: ADN (transcripción) → ARN (traducción) → Proteína

Notas de laboratorio y conceptos clave

• FLUG: Madura los conidios.
• Liofilizado: Quita el agua en frío (evaporación en frío).
• EDTA: Inhibe las nucleasas o endonucleasas.
• Los primers están hechos de ARN para replicaciones in vivo y de ADN para replicaciones in vitro.
• Todas las polimerasas requieren un buffer de magnesio para amplificar.
• La Taq polimerasa tiene una tasa de error considerable.
• Nunca hay unión entre dos purinas o dos pirimidinas; eso se considera una mutación.
• Limitantes de la PCR: Cantidad de nucleótidos, cantidad de primers y la eficiencia de la polimerasa.

Replicación del ADN

• La doble hélice es desenrollada y cada hebra sirve para la síntesis de una nueva cadena.
• Cadena continua: La síntesis de la proteína es seguida.
• Cadena retrasada: La síntesis se realiza por fragmentos.