Técnicas de Extracción, Purificación y Análisis de Ácidos Nucleicos y Proteínas

Técnicas de Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos

ADN de plásmidos

• Lisis por calentamiento: Utiliza un tampón y lisozima. Se centrifuga para separar los restos celulares de la solución de ADN plasmídico y finalmente se precipita el ADN purificado.
• Lisis alcalina: Emplea SDS y NaOH. El ADN genómico precipita, mientras que el ADN plasmídico renaturaliza más rápido y permanece en disolución.

Preparación de ARN

• Lisis con detergente y fenol ácido: Desnaturaliza proteínas, elimina ADN y estabiliza el ARN.
• Centrifugación: Elimina contaminantes, quedando el ARN en la fase acuosa superior.
• Precipitación y lavado con etanol
• Tratamiento con ADNasas

Secuenciación de ADN

• Método de Sanger
• Método automático de secuenciación

Técnicas de Extracción y Purificación de Proteínas

Métodos de ruptura celular y extracción de proteínas

• Ruptura celular:
  • Lisis celular
  • Destrucción mecánica:
    • Homogeneización: Las células pasan entre un tubo y un pistón de vidrio.
    • Detergentes:
    • French press: Las células pasan a gran velocidad a través de un pequeño orificio.
    • Sonicación: Somete las células a vibraciones de ultrasonido.
    • Congelación-descongelación
• Extracción de proteínas mediante centrifugación diferencial

Métodos cromatográficos para separación de proteínas

• Cromatografía en columna:
  • Cromatografía de exclusión molecular o de filtración en gel: Separa según el tamaño de las partículas.
  • Cromatografía de intercambio iónico: Separa según la carga de las proteínas.
  • Cromatografía de afinidad: Utiliza ligandos específicos para unirse a proteínas de interés.

Métodos electroforéticos para la separación de proteínas

• Electroforesis en SDS-PAGE: Desnaturaliza proteínas y las separa según su peso molecular.
• Geles en gradiente de concentración: Separa proteínas según su tamaño de poro.
• Isoelectroenfoque: Separa proteínas según su punto isoeléctrico.
• Electroforesis bidimensional: Separa proteínas según dos propiedades moleculares.