Técnicas Fundamentales de Ingeniería Genética

Clonación de Genes

Clonar un gen consiste en obtener muchas copias del mismo, ya sea para estudiarlo o para obtener en grandes cantidades la proteína específica que codifica. La técnica de clonación de genes comprende varias etapas:

• Obtención del gen que se quiere clonar: Esta etapa consiste en aislar el fragmento de ADN que contiene el gen que se quiere clonar.
• Inserción del gen en un vector de clonación: En esta etapa, el gen se une a un vector de clonación, que sirve de vehículo para transportarlo dentro de la célula hospedadora. Los vectores de clonación suelen ser plásmidos, que son pequeñas moléculas de ADN circulares, capaces de autorreplicarse dentro de las células hospedadoras independientemente de los cromosomas de estas. Para unir el gen al vector de clonación, primero se corta mediante enzimas de restricción. Estas enzimas producen cortes asimétricos, generando fragmentos monocatenarios denominados extremos cohesivos o pegajosos. El fragmento de ADN que contiene el gen debe ser sometido a la acción de la misma restrictasa para que presente los mismos extremos cohesivos. Posteriormente, el gen se une al vector por acción de otras enzimas llamadas ADN ligasas, formándose ADN recombinante (que contiene segmentos de distinta procedencia).
• Introducción del vector de clonación con el gen en la célula hospedadora: En esta etapa, el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar se introduce en una célula hospedadora para que esta, al multiplicarse, origine un clon de células portadoras de dicho gen. Las células hospedadoras para ser utilizadas en la clonación deben tener las siguientes características:
  • Poseer un crecimiento rápido.
  • No ser patógenas.
  • Ser capaces de captar del medio moléculas de ADN e incorporarlas en su genoma.

  Se suelen utilizar como células hospedadoras bacterias: Escherichia coli y levaduras: Saccharomyces cerevisiae.

Reacción en Cadena de la Polimerasa o Técnica de la PCR

La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha dado nuevas alas a la ingeniería genética y a toda la biología molecular. Fue inventada por Kary Mullis en 1985. Es una técnica que, basándose en la capacidad de la ADN polimerasa para replicar el ADN, permite obtener en el laboratorio, a partir de un fragmento determinado de ADN, un número ilimitado de copias del mismo en muy poco tiempo.

El proceso es muy sencillo: se necesita el fragmento de ADN que se quiere replicar, un tubo de ensayo, una concentración suficiente de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato que formarán las nuevas réplicas, una fuente de calor, unas pequeñas cadenas de nucleótidos que actúan como cebadores y la ADN polimerasa (se utiliza la ADN polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales: Thermus aquaticus, que aguanta temperaturas altas). Este es un proceso cíclico; cada ciclo dura aproximadamente 5 minutos y consiste en lo siguiente:

1. La molécula o fragmento de ADN que se va a replicar se calienta a 100 °C para que se desnaturalice y se separen las dos hebras.
2. Después, se baja la temperatura para que las cadenas se unan a los cebadores y se repliquen por acción de la ADN polimerasa.
3. Posteriormente, se vuelve a subir la temperatura para que las moléculas recién formadas se desnaturalicen de nuevo y comience otro ciclo. Estos ciclos se repiten hasta que se obtiene el número de copias deseado.

Aplicaciones de la PCR

Algunas de las aplicaciones más importantes de la PCR son:

• Clonación de genes: La PCR resulta útil en la clonación de genes, ya que permite obtener un gran número de copias del gen sin la intervención de células.
• Estudios evolutivos: Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos a partir de cantidades muy pequeñas de ADN presentes en algunos fósiles, para comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y reconstruir el árbol filogenético.
• Huellas genéticas (Fingerprinting de ADN): La determinación de las huellas genéticas constituye una de las aplicaciones más interesantes de la PCR. Mediante esta técnica es posible comparar diferentes muestras de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no, o si existe parentesco entre ellas. Esta técnica se aplica actualmente en medicina forense e investigaciones policiales, con el fin de identificar individuos a partir de muestras biológicas, como sangre, semen, piel o cabello. También se utiliza en las pruebas de paternidad.

Transgénesis

Es la técnica que permite modificar el genoma de un organismo mediante la introducción de genes nuevos (exógenos) o la modificación de un gen propio, lo que hace que el organismo muestre una nueva característica. El gen insertado puede proceder de cualquier individuo, especie, o incluso ser un gen sintético producido en el laboratorio. Se utiliza para conseguir organismos transgénicos, que se caracterizan por tener el genoma de todas sus células modificado; esto solo se consigue si se modifica el genoma de las células germinales o las embrionarias, ya que el gen introducido se transmite a la descendencia. La transgénesis también se utiliza en la terapia génica para la corrección de defectos genéticos; en este caso, solo se modifica el genoma de algunas líneas celulares.

Método de Edición Genómica CRISPR-Cas

Se basa en el sistema de defensa que tienen las bacterias, denominado CRISPR, que detecta la presencia de ADN procedente de un virus y lo destruye mediante la proteína Cas9, que corta este ADN y lo inactiva. Este sistema se puede introducir en cualquier organismo, incluso el ser humano, permitiendo producir un corte en el ADN y editar un gen determinado. De esta manera, es posible inactivar un gen concreto (por ejemplo, un oncogén) o editar un gen mutado, eliminando la secuencia de la mutación y sustituirla por un nuevo fragmento con la secuencia correcta. El problema es que esta técnica corta las dos cadenas de ADN a la vez, lo cual puede generar mutaciones; sin embargo, existe un nuevo sistema de edición que genera menos mutaciones, en el que una proteína Cas9 modificada corta solo una de las cadenas de ADN, y una retrotranscriptasa que usa como molde ARN para sintetizar el fragmento de ADN con la secuencia correcta que elimina la mutación. Sus usos pueden ser los siguientes: modificación de embriones humanos, producción de biodiésel, terapia génica, modificación de la producción agropecuaria, etc.