Técnicas Fundamentales de Laboratorio: Centrifugación, Colorimetría y Potenciometría

Tipos de Centrifugación

La centrifugación es un proceso que permite la separación de componentes de una mezcla basándose en sus diferentes velocidades de sedimentación.

Centrifugación Diferencial

Separa las partículas de acuerdo a sus **diferentes velocidades de sedimentación**. Se utiliza comúnmente en la **clínica** para separar **sedimentos de orina**.

Centrifugación Zonal

Utiliza un **gradiente de densidad** (logrado con un soluto denso, siendo la **sacarosa** la más usada) para que las **moléculas** sedimenten de acuerdo a su **coeficiente de sedimentación**. La sacarosa es crucial porque **evita que las bandas se mezclen**.

Tubos de Centrifugación

La elección del tubo adecuado es fundamental para el éxito de la centrifugación y la compatibilidad química.

1. Policarbonato: Vidrio transparente, **autoclavable** y resistente a los **ácidos y bases de baja dilución**.
2. Borosilicato: Vidrio muy resistente a **químicos de alta concentración**.
3. Polietileno: Plástico resistente a químicos, pero **sensible a la temperatura**.
4. Polipropileno: Plástico bastante resistente a la temperatura, **autoclavable** y resistente a casi todos los químicos.

Portatubos

Los portatubos son de **plástico o de metal** y son poco resistentes a ácidos y bases fuertes.

Colorimetría

La colorimetría es una técnica para determinar la **concentración de una muestra** basándose en el color que presenta.

Ley de Lambert-Beer

La relación fundamental en colorimetría se expresa como:

Log (Io/It) = εlc

Donde:

• Io: Luz incidente
• It: Luz transmitida
• ε: Coeficiente de extinción molar (constante)
• l: Longitud de paso (del haz de luz a través de la muestra)
• c: Concentración de la sustancia

Fotocolorimetría y Espectrofotometría

La fotocolorimetría es la medida de la luz absorbida por una solución mediante un aparato llamado fotocolorímetro.

El **equipo consta de una fuente de luz artificial y un monocromador que separa la luz de una sola longitud de onda**.

La clasificación de colorímetro o espectrofotómetro depende del monocromador: si este es un **filtro**, tendremos un **fotocolorímetro**; si es un **prisma o red de difracción**, será un espectrofotómetro.

Los resultados se reportan de dos formas:

• Luz absorbida por las **partículas de la solución**.
• Luz transmitida luego de atravesar el tubo con la solución.

Cálculo de la Concentración de una Muestra

Existen dos métodos principales para calcular la concentración de una muestra.

1. Factor de Calibración (FC)

El factor de calibración es la concentración de sustancia que corresponde a una unidad de medida, generalmente 0.001 de absorbancia.

La fórmula para el FC es:

FC = Concentración Patrón / Lectura del Patrón (Absorbancia)

Esta fórmula se deriva de la densidad óptica o absorbancia de la muestra (DOp = εlpCp). Si el **coeficiente de extinción (ε)** es el mismo en ambos casos y la **longitud de paso (l)** del tubo de lectura es la misma, la única diferencia está en la concentración. Luego, se establece la siguiente relación:

DOst / DOp = Cst / Cp

Despejando la concentración de la muestra (Cp), obtenemos la siguiente fórmula:

Cp = DOp x Cst / DOst

Donde:

• Cp: Concentración de la muestra
• DOp: Densidad Óptica de la muestra
• Cst: Concentración del estándar (patrón)
• DOst: Densidad Óptica del estándar (patrón)

En resumen, la **Concentración de la muestra = Densidad Óptica de la muestra X Factor de Calibración**.

2. Curva de Calibración

Consiste en la **obtención de las lecturas de absorción o de % de transmitancia** que corresponden a una secuencia creciente de concentraciones. Se grafican en **papel milimetrado** si se trata de absorbancia o densidad óptica, y en **papel semilogarítmico** si se trata de % de transmitancia.

Potenciometría

La potenciometría es el procedimiento de **elección para la medida del pH**. El **pH** es una expresión numérica que corresponde al **logaritmo de la inversa de la concentración de iones H+**. La potenciometría se basa en la **diferencia de potencial (voltaje)** entre dos electrodos (el de medida y el de referencia), ambos sumergidos en la solución y bajo condiciones de equilibrio.

Instrumentos

• Electrodo de referencia: Mantiene un potencial constante durante la medida. Ejemplos incluyen el **electrodo de calomelano**, **mercurio metálico**, **cloruro mercuroso** y **cloruro de plata**.
• Electrodo de medida: Varía de acuerdo a la concentración de iones hidrógeno de la solución.
• Dispositivo o Potenciómetro: Mide la diferencia de potencial.