Técnicas de Hibridación en Biología Molecular: Fundamentos y Aplicaciones Clínicas

Introducción a las Técnicas de Hibridación

Las técnicas de hibridación son fundamentales en biología molecular para la detección y caracterización de secuencias específicas de ácidos nucleicos (ADN o ARN) o proteínas. Se basan en la capacidad de las cadenas complementarias de ADN o ARN de unirse, o en la interacción específica entre anticuerpos y antígenos (proteínas).

Tipos de Hibridación por Fase

• Hibridación en Fase Líquida: Permite un análisis limitado de híbridos.
• Hibridación en Soporte Sólido: Inmoviliza cadenas de ADN o ARN en un soporte sólido. Su cinética de hibridación es más lenta y se aplica en el estudio de enfermedades genéticas.
• Hibridación in situ: Una técnica especial de hibridación en soporte sólido, aplicada directamente en cromosomas y tejidos.

Dot Blot y Slot Blot

Estas variantes de hibridación en soporte sólido se utilizan para la detección de una sonda y su secuencia diana. Emplean un soporte sólido, como el nailon (que fija el ADN), donde se deposita una secuencia problema en forma de gota o línea.

Técnicas de Transferencia (Blotting)

Southern Blot

El Southern blot es una técnica esencial para la detección de genes o fragmentos de ADN específicos, separados previamente del ADN genómico. La separación se realiza por electroforesis, seguida de la transferencia a una membrana.

Pasos del Southern Blot:

1. Extracción del ADN.
2. Digestión con endonucleasas de restricción.
3. Separación electroforética de los fragmentos de ADN.
4. Desnaturalización del ADN en el gel.
5. Transferencia del ADN a una membrana (ej. nitrocelulosa o nailon).
6. Hibridación con una sonda marcada.
7. Detección de la sonda hibridada.

Northern Blot

El Northern blot es una técnica que detecta moléculas de ARN. Es similar al Southern blot en su principio, ya que las moléculas de ARN se separan por electroforesis y se transfieren a una membrana.

Diferencias clave con el Southern Blot:

• Requiere la extracción de ARN total (no ADN).
• No utiliza enzimas de restricción.
• El ARN es sensible a la degradación por ribonucleasas, por lo que se requiere especial cuidado.
• La fijación del ARN a la membrana a menudo se realiza con luz ultravioleta.

Western Blot

El Western blot es una técnica de transferencia utilizada para el estudio de proteínas, a diferencia de las anteriores que se centran en ácidos nucleicos. No implica hibridación de ácidos nucleicos, sino la detección de proteínas mediante anticuerpos.

Pasos del Western Blot:

1. Extracción de proteínas de tejidos o células.
2. Electroforesis en gel (generalmente SDS-PAGE) para separar las proteínas por tamaño.
3. Transferencia de las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa o PVDF. El montaje típico para la transferencia incluye: esponja, papeles de filtro empapados con tampón de transferencia, gel, membrana, y nuevamente esponja y papel.
4. Bloqueo de la membrana para evitar uniones inespecíficas.
5. Incubación con un anticuerpo primario específico para la proteína de interés.
6. Incubación con un anticuerpo secundario marcado (ej. con una enzima o fluorocromo).
7. Detección de la proteína marcada.

Hibridación in situ Fluorescente (FISH)

La FISH es una técnica citogenética que permite el marcaje de cromosomas o regiones específicas de ADN con una sonda fluorescente. Es ampliamente utilizada para el diagnóstico de alteraciones cromosómicas y de la expresión genética.

Inicialmente, se empleaban sondas marcadas radioactivamente, pero estas fueron sustituidas por oligonucleótidos sintéticos marcados con grupos fluorescentes, lo que mejoró la seguridad y la resolución.

Tipos de Sondas FISH

Las sondas FISH están marcadas para reconocer determinadas regiones de los 23 pares de cromosomas. Los colores básicos de marcaje incluyen rojo, naranja, verde y azul.

• Sonda Centromérica: Dirigida al ADN satélite de los centrómeros. Se utiliza para la detección de anomalías cromosómicas numéricas (ej. trisomías), a menudo visualizada como una señal roja en el medio del cromosoma.
• Sonda Subtelomérica: Dirigida a las regiones subteloméricas (terminales) de los cromosomas. Permite la detección de deleciones y duplicaciones en estas regiones, visualizadas como señales rojas o verdes en las puntas.
• Sonda de Locus Específico: Dirigida a genes o regiones de ADN conocidas. Es fundamental para el diagnóstico de síndromes de microdeleción, mostrando señales verdes o rojas en el medio o puntas, según el locus.
• Sonda de Pintado Cromosómico (Chromosome Painting): Consiste en una suma de múltiples sondas que “pintan” el cromosoma entero. Se utiliza para detectar reordenamientos cromosómicos complejos, como translocaciones, y se visualiza a menudo con un color verde uniforme en el cromosoma afectado.

Preparación para FISH

1. Preparación de extensiones cromosómicas o cortes de tejido para hibridación.
2. Desnaturalización del ADN de la muestra (separación de las dos hebras).
3. Deshidratación de las preparaciones en frío.
4. Desnaturalización de las sondas (si son de doble hebra).
5. Aplicación de la sonda en el portaobjetos con la muestra.
6. Incubación para permitir la hibridación de la sonda con su secuencia diana.
7. Lavado de la preparación para eliminar sondas no unidas.
8. Secado de la muestra.
9. Contratinción fluorescente (ej. DAPI, yoduro de propidio) para visualizar los cromosomas.
10. Estudio microscópico de fluorescencia para la interpretación de los resultados.

Variantes de FISH y Aplicación Clínica

Existen diversas variantes de FISH que amplían sus capacidades, como Fiber FISH, M-FISH (FISH multicolor), CGH (Hibridación Genómica Comparada) y CGH array.

La aplicación clínica de FISH es muy amplia, permitiendo la identificación de alteraciones cromosómicas en el diagnóstico prenatal, postnatal, en oncología, y en el estudio de enfermedades genéticas.

CGH Array (Hibridación Genómica Comparada en Array)

El CGH array es una técnica citogenética avanzada que permite el análisis simultáneo de todos los pares de cromosomas. Es especialmente útil para detectar aneuploidías en células individuales, así como ganancias o pérdidas de material genómico (variaciones en el número de copias o CNVs).

Proceso del CGH Array:

• El ADN diana (del paciente) se marca con un fluorocromo ROJO.
• El ADN control (de un individuo sano) se marca con un fluorocromo VERDE.
• Ambas muestras de ADN se mezclan y se desnaturalizan.
• La mezcla desnaturalizada se añade a los pocillos de un microchip (array), donde cada pocillo contiene una sonda de ADN específica para una región genómica conocida.
• Tras la hibridación y los lavados, se realiza la lectura de la intensidad de fluorescencia en cada pocillo.

Resultados del CGH Array:

• Si hay una duplicación en el ADN diana, se observará un exceso de señal ROJA en la región correspondiente del array.
• Si hay una deleción en el ADN diana, se detectará una pérdida de la región de ADN diana, lo que se manifestará como un exceso de señal VERDE (del ADN control) en esa región.
• Una señal amarilla (mezcla equitativa de rojo y verde) indica una proporción normal de ADN.