Técnicas de Hibridación: Fundamentos y Aplicaciones Clave
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1. ¿En qué consisten las técnicas de hibridación?
Es la técnica en la cual se une una secuencia diana para detectar la presencia y características de la secuencia que se desea conocer.
2. ¿A qué corresponde la segunda zona B de la curva de fusión del ADN?
A la desnaturalización de la molécula.
3. Concepto de Tm de una molécula de ADN:
La Tm (temperatura de fusión) de una molécula bicatenaria de ADN es la temperatura a la cual la desnaturalización alcanza el 50%.
4. Enumera los factores que influyen en la velocidad de la renaturalización del ADN:
Los factores que influyen son: la concentración de ADN monocatenario en un tiempo t determinado (C), la concentración inicial a t=0 (C0), y la constante de reasociación (K).
5. Enumera las fases de una curva de renaturalización de un genoma eucariota:
Las fases son:
- Componente rápido: secuencias altamente repetidas.
- Componente intermedio: secuencias moderadamente repetidas.
- Componente lento: secuencias únicas.
6. ¿Cómo afecta la fuerza iónica de una solución a una reacción de hibridación?
Cuanto mayor es la concentración de cationes en la solución, más energía en forma de calor hay que aportar al híbrido para desnaturalizarlo.
7. ¿Qué caracteriza a una sonda de hibridación muy específica?
Suelen ser más largas (+16 nucleótidos), ya que así no se unen a zonas complementarias no deseadas. Al ser de mayor tamaño, tienen más nucleótidos y es más difícil encontrar la secuencia complementaria en el ADN (muestra).
8. Enumera las características de las sondas de ADN recombinante:
Las características son: largas (cientos o miles de pb), muy específicas y sensibles. Se puede usar el plásmido como sonda o extraer la sonda. Debido a su tamaño, son menos permeables y son bicatenarias.
9. Enumera los inconvenientes de las sondas PNA:
Los inconvenientes son: su solubilidad es mucho menor que las de ADN y ARN, y disminuye drásticamente con la longitud. Solo se pueden obtener por síntesis química.
10. Utilidad de los fluorocromos en las técnicas de hibridación:
Los fluorocromos se usan para marcar la sonda. Tras la hibridación, al ser estimulados con luz UV, permiten detectar que la sonda se ha unido a la secuencia diana. Permiten detectar simultáneamente varias secuencias diana. Los marcadores de fluorocromo se acoplan bien a los nucleótidos y no alteran la especificidad de la sonda.
11. ¿Qué reactivos son necesarios para el marcaje de una sonda de hibridación con isótopos radiactivos por el método de cebado aleatorio?
Se necesita: una mezcla de todos los oligonucleótidos posibles de 6 bases (hexámeros), fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I, y una mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfato, uno de ellos marcado.
12. ¿Qué función tiene la ADNasa I en el método de marcaje de sondas por desplazamiento de mella?
Romper el enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos consecutivos al azar en ambas cadenas de la sonda.
13. ¿Con qué se debe incubar una sonda para marcarla según el método de marcaje terminal por marcaje único en el extremo?
Se incuba con TdT (desoxinucleotidil transferasa terminal) y un desoxinucleótido trifosfato marcado. Los didesoxinucleótidos no tienen un OH libre en el carbono 3', por lo que se incorporan a una cadena de ADN y detienen la elongación.
14. Enumera los métodos empleados en la purificación de la sonda marcada:
Los métodos son: la cromatografía de exclusión por tamaño y la cromatografía de adsorción.
15. ¿Qué parámetro hay que fijar en un lavado post-hibridación para conseguir las condiciones de rigurosidad deseadas?
Se debe fijar la temperatura, la carga iónica de la solución, y la presencia y concentración de agentes desnaturalizantes (formamida).
16. ¿Qué caracteriza a las técnicas de hibridación en soporte sólido?
Que una de las dos secuencias implicadas, la secuencia diana o la sonda, se inmoviliza sobre un soporte sólido previo a la hibridación.
17. ¿Cómo se une el ADN de forma permanente a la membrana en una técnica de dot blot?
En membranas de nailon, se usa luz UV. En membranas de nitrocelulosa, se incuba a la temperatura adecuada (aproximadamente 80°C) durante el tiempo necesario.