Hibridación molecular: tipos de sondas y métodos de marcaje

Hibridación Molecular: Conceptos Básicos

La hibridación es la unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos (AN) por la complementariedad de su secuencia de bases nitrogenadas, originando una molécula híbrida bicatenaria.

Técnicas de Hibridación

Las técnicas de hibridación permiten detectar secuencias concretas de ácidos nucleicos o dianas mediante sondas marcadas.

Factores que Afectan la Hibridación

• Fuerza iónica de la solución: A mayor concentración de cationes monovalentes, mayor será la temperatura necesaria para desnaturalizar el ADN.
• Agentes desnaturalizantes: El dimetilsulfóxido (DMSO) y la formamida facilitan la ruptura de los puentes de hidrógeno.
• Porcentaje de bases no complementarias: A mayor mismatch (bases no complementarias), menor será la temperatura de fusión (Tm).

Tipos de Sondas

Sondas de ADN

1. De síntesis química

Obtenidas por condensación química secuencial de los desoxinucleótidos.

Características:

• Monocatenarias (no requieren desnaturalización por calor en la hibridación).
• Tamaño reducido (mejor penetración en el tejido).

Inconvenientes:

• Baja sensibilidad.
• Facilidad para hibridar inespecíficamente.

2. De ADN recombinante

Procedimiento:

1. El fragmento de ADN que se empleará como sonda se inserta en un vector (un plásmido bacteriano).
2. El plásmido se introduce en una bacteria y se cultiva en un medio apropiado.
3. Se extrae el plásmido amplificado y se emplea entero como sonda o se separa el fragmento de interés con enzimas de restricción.

Características:

• Son bicatenarias.
• Gran tamaño, por lo que tienen mayor sensibilidad.
• No suelen hibridar inespecíficamente, presentando mayor especificidad.

3. PCR

Amplificación del fragmento de interés por PCR.

Características:

• Bicatenarias.
• Tamaño intermedio.

Sondas de ARN

Siempre son monocatenarias, más estables, pero más sensibles a la contaminación.

1. De síntesis química

Condensación química de los ribonucleótidos concretos.

2. Transcripción in vitro

Transcripción de un vector que contiene el fragmento de interés o un ADNc mediante una ARN polimerasa.

Sondas Químicas Sintéticas de Ácidos Nucleicos

1. De ácidos nucleicos peptídicos (ANP)

Oligómeros sintéticos en los que el esqueleto típico de azúcar-fosfato es sustituido por uno de aminoetil-glicina unidas por enlaces amida.

Diferencias con las sondas de ADN:

• No tienen carga eléctrica.
• No son degradadas por nucleasas ni proteasas, aportando gran estabilidad.

Ventajas:

• Hibridan rápidamente.
• Los híbridos son más estables que los ADN/ADN y ARN/ARN.
• La fuerza iónica del medio influye poco en la estabilidad de los híbridos.
• Son muy específicos por su capacidad de discriminar bases no complementarias.

Inconvenientes:

• Menor solubilidad, que disminuye con la longitud.
• Solo se obtienen por síntesis química.

2. De ácidos nucleicos bloqueados (ANB)

Oligómeros sintéticos de ribonucleótidos en los que se modifica químicamente la ribosa mediante un puente O2 entre el carbono 2' y 4' (mayor sensibilidad y especificidad).

Marcaje de Sondas

El marcaje consiste en marcar la sonda utilizada en la hibridación para visualizar los resultados.

Tipos de Marcaje

1. Isótopos radiactivos

Elementos químicos con capacidad de emitir radiaciones (fósforo-32 y tritio). Se detectan mediante autorradiografía con película de rayos X.

2. Fluorocromos

Compuestos químicos que emiten luz al ser excitados por luz UV. Se detectan mediante microscopía de fluorescencia.

3. Haptenos

(Digoxigenina y biotina) Requieren métodos de revelado. Son moléculas pequeñas que se pueden acoplar a los nucleótidos sin alterar la especificidad de la sonda.

Métodos de Marcaje

1. Desplazamiento de mella (Nick translation)

Se incuba una determinada cantidad de sonda con ADNasa I, ADN polimerasa I bacteriana y una mezcla de desoxinucleótidos trifosfato con uno de ellos marcado.

Procesos durante la incubación:

1. La ADNasa I rompe enlaces fosfodiéster entre dos nucleótidos consecutivos, produciendo mellas.
2. La ADN polimerasa I intenta reparar las mellas eliminando nucleótidos desde la mella hacia el extremo 3' e incorporando desoxinucleótidos, sustituyendo ADN sin marcar por ADN marcado.

2. Cebado al azar o aleatorio (Random priming)

La sonda se incuba con una mezcla de oligonucleótidos, fragmento Klenow de la ADN polimerasa I y una mezcla de desoxinucleótidos trifosfato, uno de ellos marcado.

Fases:

1. Desnaturalización de la sonda.
2. Unión de los hexámeros a las cadenas de la sonda.
3. Los hexámeros actúan como cebadores para que la ADN polimerasa sintetice cadenas complementarias, incorporando los desoxinucleótidos, con uno de ellos marcado.

3. Marcaje terminal

Se usan las enzimas desoxinucleotidil transferasa terminal y ADN polimerasa.

Posibilidades:

• Marcaje único en el extremo 3'.
• Incorporación de una cola de nucleótidos marcados.

4. Marcaje por PCR

Introduciendo desoxinucleótidos marcados o haptenos en la mezcla de reacción.

5. Marcaje de sondas de ARN

Añadiendo ribonucleótidos marcados a la mezcla de reacción.

Purificación de la Sonda Marcada

• Cromatografía de exclusión por tamaño.
• Cromatografía de adsorción.