Técnicas Histológicas: Guía Completa para el Procesamiento de Tejidos

Materiales

• Cassetes
• Bisturís
• Pinzas
• Tijeras
• Sonda guía
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Mechero de alcohol

Reactivos

• Formol
• Xilol
• Alcoholes de distintas graduaciones
• Agua destilada
• Parafina
• Colorantes
• Medio de montaje

Equipos de Histotecnología

• Estación de tallado (aspirador, vapor de formol, grifo de agua, accesorios instrumentales)
• Procesador
• Estación de parafina o parafinero
• Micrótomo (porta bloques, soporte de cuchilla, mecanismo de precisión o de avance)
• -Baño de flotación
• -Placa calefactora
• -Estufa

Equipos Comunes

• Teñidores manuales y automáticos
• Montadores automáticos

Eficiencia

• Indicadores de tiempo de demora
• Indicadores de cantidad de muestras
• Indicadores de cantidad de trabajo
• Estadísticas de servicio procesado
• Indicadores de patologías

Riesgo Laboral

• OSHA 1992: 0,75 ppm
• Ley 31/1995 del 8 de noviembre de prevención de riesgos laborales
• Riesgos biológicos: RD 674/1997 del 12 de mayo de clasificación de riesgos
• Tipos de residuos: Decreto 460/1997

Errores

• Problemas de recepción y numeración de muestras
• Puntos más vulnerables: etapa analítica, transferencia de tejidos a bloques, cortes, montaje y examen de láminas, y transcripción de informes

Fijadores Físicos

Congelación

• Isopentanol: -50 a -60 °C
• Nitrógeno líquido: -196 °C
• Hielo seco y acetona: -70 °C
• Hielo líquido

Crioprotectores

• Dimetilsulfóxido
• Glicerol
• Sacarosa

Descalcificación

• Ácidos fuertes
• Tiempo excesivo: daño nuclear, maceración del tejido
• Cuanto más agresivo, más deterioro de enzimas y antígenos para pruebas enzimáticas o inmunohistoquímicas
• ARN citosol, por lo que las pruebas HIS se ven comprometidas

Agentes Quelantes

• EDTA
• Soluciones acuosas o tamponadas al 10-14%
• Proceso lento (semanas)
• Acelera con pH más alto, pero daña el tejido

Deshidratación

• Alcohol etílico
• Alcohol isopropílico
• Propanol
• Acetona
• 50%, 70%, 96%, 100%

Características

• No deben alterar la estructura tisular
• Deben ser rápidos
• No deben endurecer demasiado
• Baja toxicidad y peligrosidad

Aclaramiento

• Benceno
• Xilol
• Tolueno
• Cloroformo

Agentes más adecuados

• Depende de la rapidez para eliminar la deshidratación
• Como mantenga la estructura, facilitará la eliminación
• Toxicidad y peligrosidad

Xilol

• Más rápido
• Endurece poco
• Uso y eliminación fáciles

• Pero:
• Vuelve blanquecino
• En tiempos largos, endurece
• Solo actúa desde alcohol absoluto

Inclusión

Parafinas

cereo+sust plastic +aditivos. insol agua pero soluble eter benceno xileno tolueno. 45 y 60ºC 54 58 paraplast parafina pura + polimeros 57º no frag corta liq Celoidina ac nitric sore celulosa - ojos vasos embriones grandes piezs GElatina no precisa deshidratacion,usa tej adiposo, escasa retraccion Plasticos y resinas ME 60-100nanom MO 0,5-1 micrometro Realiz bloq ME recomend soluc fij tienen glutaraldehido xloq necesita postfijacion en tetroido de osmio preserv ultraest no perder lip. -aclarante usa oxido d propileno -endurec polim 60º -medio añaden aceleradores y plastificanes q regulan caract polim y dureza -epoxy viscosa ytoxica  Microtomo congel secciones pincle tampon flotacion Criostato -20-30 y -50. Encastra liq ambiene Seciones adhieren porta con superf adhesv q descong rapidp y procesan

EJERCICIOS aspect descrip macroscópic morf gen, dimens, coloración, lesiones macrosc evidenciales y relac con otras estruct. importante ident partes normales

y patológ, selección zonas +represent posibili diagnóst y det ext lesiones y estado bordes quirúrg pa su inclusión en proces histológ procesamiento tejido sirve para prep tej para observ a microsc,importante ya que composic tej no tienen contrastes ni colores para dif estruc claramente y precisa. tb es fundament para evitar deterioro d muestras important manten muest bio tras análisis? ¿tanto tiempo como? volver realiz pruebas si hay un proble procesado hist tejido, cuando es necesario revisar tej diagnostic años antes x si tumor es metástas d anterior diagnostic o new, investigación (estud dianas terap para trat con new fármac) o estudio genétic cáncer familia./// Si, si tamaño almacén lo permite.si no mantener x - hasta elab diag definit. principales caract fij quím en func d lo q queramos o la muestra q tengamos son: -Veloc fijac → depende d prop quím fij y condiciona

tiempo tejido contacto con fij. -Veloc penetrac → proceso debe ser rápido, veloc difusión sustanc fijadora en tejidos factor determinant. condiciona tamaño pieza y tiempo fijac. microondas permite calent forma uniforme y homogénea d forma inmediata toda la prep, evitando errores pueden produc forma manual teniendo que revolver la prep continuament descalcificación para elimin sales d calcio presentes en tej previam fijados. rutina tejidos mineralizados=huesos y dientes esporádicamente biopsias con calcifi impidan correcto proces y observ. se emplean principalmen áci fuertes o débil aisladamente o en conjunto con otros component como líq fij y agent quelantes (EDTA). artefactos cualquier alterac indeseada introduc en muestra d tej debido a téc proc realiz para su obse. a veces inevitables pero mayoría consecuencia mal proc histológico x lo q esencial reconocerlos para buena interpret y diag, especialmente en muestras patológicas. →  principales artefact: -Fija:distorsionar forma, color aspecto -Tallado: no dejar secar demasiado evitar det estruct tisular y dañar cél -Procesado: mala deshidrata no penet parafina el corte y diagnóstico, error orientación perder lesión. -Coloración: exceso o defecto no ver correct estruc tisul -React tinción mal elab, conserv, utilizados o caducados: precipitados y depósitos produc sobre tej -Montaje: cortes arañazos en cortes perdiendo parte muestra. burbujas aire entre cubre y  porta dific diag. dif entre bloques ME MO estudio ME secciones ultrafinas (nanomet) Para conseguirlas necesario endurec tej incluyendo en resinas Epoxy. proceso se dif modo endurecimiento, polimerización 60º, no enfriamiento, medios de inclusión añaden agent acelerantes o plastificadores modifiquen caract resina. proceso de orientación orientación esencial obtener corte y diag post correc sin distorsión de las estructuras. importante base del molde parte donde inician cortes, parte + blanda inicio cortes intermedio óptimos para visualización. muestra coloc forma perpendic, mucosas y piel, procesador de tejidos es equipo para deshidra, preimpreg infilt d muestras biológ forma automatiz. Permite automatiz y obtención de tej infiltrados listos para cortes= ahorro tiempo y dinero. trabaja con dif muestras al mismo tiempo= ahorro materiales (parafina, xilol o alcohol) métodos de inclusión.Paraplast: U- = parafina V-No fragmenta ni necesario se enfríe para secciones. Celoidina U-Incluir ojos, vasos y embriones V-grandes piezas. Gelatina U-Encastración de muestras. V- No deshidratación. Útil estudio t. adip.Poca retracción tisular. Plásticos y resina Usados obtención de secciones: ultrafinas = MO semifinas = MO V- Conser bien estructuras subcel. Endurecen por polimerización. deshidratación?  extra agua de pieza endurecerla aumentar consistencia. importante xq ag inclusión no hidrosolubles y sin ella  agente no puede penetrar célul y estructuras. agentes deshidratantes + empleados soluc concentraciones crecientes metanol (50º, 70º,

96º y absoluto) u otros agentes como alcoholetílico, isopropílico, propanol, acetona, etc. inicia  lavado pieza agua eliminar restos d fijadores, pieza sumerge 1º  solución menor

concent y luego en soluciones de 70º, 96º y absoluto. necesario baños cortos y rápidos para provocar menor grado endurec tisular y no alterar las estruct presentes.

xilol ventajas e inconvenientes, aclaramiento ventajas es el + rápido, endurece poco los tejidos y uso y eliminación muy fáciles. inconvenientes muy tóxico volver blanquecino tejido, tiempos prolong endurece tejido y solo actúa como aclarante desde alcohol absoluto. Realizando varios baños con ag aclarant, para evitar q se pierdan sus propiedades. realización de bloques. va a depender de si estudio en. MO: se  hace con parafina, esta debe estar encima punto fusión antes de sumergir muestra en ella, mantenerla líquida durante todo proceso. Para mejores resultaos varios baños y si proceso es manual el 1º realizaremos en una mezcla crecient d parafina y decrec ag aclarante. ME secciones ultrafinas x lo q necesario alto grado endurec d tejidos x lo q medio inclus resinas EPOXI o acrílicas. método d infiltración = q con parafina pero endurec por polimerización, no enfriam. Necesario tener en cuenta: -Puede ser necesaria una postfijación tetróxido de osmio -muestras de menor tamaño  -Añadir aceleradores y plastificantes a medios inclusión .Uso D resinas como medios inconvenientes: elevada viscosidad dificult penetracy elevada toxicidad. tipos micrótomos  -para parafina: se usa para material incluido en parafina y MO.  -Microtomo manual: dispositivo muy sencillo. consta d soporte

sujetar muestra y cortes a manocuchilla, cortes gruesos MO -Vibratomo: corta matl no incluido aunque sí fijado o duro en secciones para MO de congelación: a partir d mat congelado y MO -Criostato: secciones material congelado, + finas q anterior y MO -Ultramicrotomo: corta matl incl resinas, obtienen secciones orden d nanómetros vistos MET. Tb semifinas MO -Ultramicrotomo: orden nanómetros, mat no debe incluir. MET

vibratomo princ dif cuchilla avanza sobre muestra ymovimiento vibración lateral a modo de sierra q facilita corte y evita arrastrar tejido. muestras adheridas bloque portamuestras

pegamento. proceso solución acuosa tamponada o salina. muestra y borde cuchilla sumerg. cortes en flotación y procesados flotando o adherir portaobjetos para procesa +tarde. proceso adhesión conocido como pesca. micrótomos cortes parafinaD rotacion o minot VENTAJAS:-Gran precisión - secciones seriadas con facilidad -Automatización proceso corte motores eléc INCONVENIENTES: Microt deslizam VENTAJAS: + sencillos mecánic - disposición permite cortar bloques +grandes y celoidina INCONVENIENTES: -Alto riesgo cortes accidentes-Procesos d corte lentos Micrótomos -D Leitz o porta bloques deslizantes: portabloques se desliza sobre cuchilla fija. cortes + inalterables y mejor calidad no vibra. -Reichert-Jung o cuchilla móvil: cuchilla sobre porta= pequeña vibración.-Tëranderm: tipo d microtomo d cuchilla móvil específico, q se usa para secciones macro o microscópicas de órganos completos.