Técnicas de Inmunohistoquímica y Optimización de Procesos

Tipos de Inmunohistoquímica

1. Inmunofluorescencia (IF)

Existen dos tipos principales de fluorescencia: la **fluorescencia**, en la que las moléculas con esta propiedad emiten radiación al ser excitadas, y la **quimioluminiscencia**, que produce luz mediante una reacción química.

Las **sustancias fluorescentes** utilizadas en entornos clínicos deben poseer una gran intensidad de luz, ser estables para su almacenamiento y no deben ser alteradas por la unión **antígeno-anticuerpo (Ag-Ac)**. Además, la fluorescencia puede ser **intrínseca** si está presente en las muestras de manera natural, o **extrínseca** cuando se añaden moléculas fluorescentes a otras que no lo son para conferirles esta propiedad. Los compuestos fluorescentes más usados incluyen la **fluoresceína (FITC)**, **rodamina**, **Cy3**, **Cy5** y **Alexa (Molecular Probes)**.

Inmunofluorescencia Directa (IFD) e Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)

En la **Inmunofluorescencia Directa (IFD)**, solo se utiliza un **anticuerpo primario** marcado. En contraste, en la **Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)**, se emplea un anticuerpo primario que se une al antígeno, y un **anticuerpo secundario** marcado que se une al anticuerpo primario.

Los **fluoróforos** se degradan con la interacción del oxígeno, lo que dificulta la conservación de las muestras. Este fenómeno se conoce como **fotoblanqueo** (*photobleaching*).

• El núcleo se suele colorear de azul.
• El color verde es a menudo el preferido, ya que ofrece una mejor diferenciación y mayor durabilidad.

2. Técnica Inmunoenzimática

Esta técnica es similar a la enzimohistoquímica y consiste en unir una **enzima** a un **anticuerpo**. Una vez que el anticuerpo se une al **antígeno**, se añade un **sustrato** a la muestra, el cual es catalizado por la enzima, generando un **producto coloreado**. Las enzimas más utilizadas son la **Peroxidasa (HRP)** y la **Fosfatasa Alcalina (AP)**. Cada enzima puede catalizar varios sustratos, lo que permite una amplia gama de colores y reacciones.

3. Técnica Avidina-Biotina

La **avidina** y la **biotina** son dos proteínas con alta afinidad mutua, lo que las lleva a unirse fuertemente. Esta técnica consiste en marcar un anticuerpo con biotina. Posteriormente, se añade avidina que se une a la biotina, y finalmente se incorpora avidina marcada con enzimas. Estas enzimas catalizan un sustrato que produce color. Una ventaja clave de esta técnica es su capacidad para **amplificar la señal**.

Posibles Problemas en el Procesamiento

Un procesamiento inadecuado puede comprometer la calidad de los resultados. A continuación, se detallan los puntos críticos:

• Fijación: Debe ser inmediata para evitar la **putrefacción** y la **autólisis**. El proceso debe ser óptimo para prevenir la degradación de las **inmunoglobulinas**. Se recomienda el uso de **fijadores precipitantes** como la **solución de Zenker**.
• Descalcificación: Debe realizarse con **EDTA**, ya que los ácidos pueden eliminar por completo la **inmunorreactividad**.
• Inclusión: Se recomienda usar **acetona** en lugar de etanol y **cloroformo** en lugar de xileno. Es crucial eliminar completamente la **parafina**.
• Congelación: A menudo, el proceso de **congelación** es el más recomendable, ya que permite omitir los pasos anteriores y minimizar la mayoría de los errores de procesamiento.

Pérdida de Antigenicidad

Si el procedimiento es incorrecto, los **epítopos** de los **antígenos** pueden enmascararse, impidiendo su unión a los anticuerpos. A continuación, se presentan posibles soluciones:

1. Uso de enzimas: Se pueden emplear **enzimas** que rompen los enlaces cruzados y revelan los epítopos. Sin embargo, una digestión enzimática excesiva puede dañar el tejido o generar **señal inespecífica**, y no es aplicable a todas las muestras.
2. Inducción por calor (HIER): Es la técnica más utilizada. Consiste en aplicar calor para revelar los epítopos, introduciendo la muestra en un dispositivo de calentamiento (como un microondas) junto con **citrato sódico**.