Técnicas de Microscopía y Procesamiento de Muestras Biológicas

Parámetros Ópticos y Preparación de Muestras

Parámetros ópticos: aumento, poder de resolución, número y profundidad de campo, contraste...

Preparación de la muestra

• Fijación: Se preserva la muestra para mantenerla. Puede ser por frío (criofijación con nitrógeno y congelador) o química (formol).
• Lavado: Se cambia el agua por alcohol (deshidratación por sucesión de alcoholes más fuertes).
• Tinción: Con orceína.
• Aclarado: Con propanol.
• Infiltración: Se infiltra parafina y se guarda en bloques.

Preparaciones histológicas

Se realizan cortes en microtomos y criostatos. Después se colocan al portaobjetos tras estirarlo y se procede al secado.

Microscopía Electrónica de Transmisión (MET)

Utiliza radiación electromagnética con longitud de onda corta. Los electrones se desvían cuando pasan por un campo magnético circular. En el vacío, los electrones se desprenden del cañón de electrones y se aceleran por el cilindro de Wehnelt.

Componentes del MET

• Fuente de iluminación (cátodo, ánodo, cilindro).
• Lentes (bobinas).
• Sistema de visión.
• Sistema de vacío.
• Sistema de frío.
• Fuente de electricidad y control de mandos.
• Inyector de muestra, más lentes y diafragmas.

Al emitirse los electrones, algunos van rectos, otros se desvían y otros salen de la muestra.

Preparación de muestras para MET

• Fijación: Glutaraldehído y después tetraóxido de osmio.
• Deshidratación: Paso por alcoholes más fuertes hasta óxido de propileno.
• Inclusión: En resinas plásticas.
• Secado y dureza: Por calor.
• Corte: Se cortan después con un ultramicrotomo y se ponen en rejillas de níquel.

Técnicas de Contraste y Réplica

• Contraste negativo de extensiones: Fijación, embeber la muestra con uranilo (sal de metal pesado, muy soluble en agua) y secado.
• Sombreado metálico: Metal pesado (platino). El metal se evapora a un lado y deja una sombra clara. Puede ser unidireccional o rotatorio.
• Réplica de superficie: Materiales plásticos, separación por medios químicos (disolución, digestión de la muestra); a veces se sombrea.
• Sombreado metálico (reiteración): Metal pesado (platino). El metal se evapora a un lado, deja sombra clara. Unidireccional o rotatorio.

Criotécnicas

Su finalidad es reducir los cambios introducidos por protocolos químicos convencionales. Suelen comenzar por una criofijación. Se reduce la pérdida de componentes solubles (no hay extracción). Se conserva mejor la conformación molecular, lo que aporta facilidad para detectar antígenos.

• Criofractura: Sin sublimar hielo.
• Criograbado: Sublimando hielo.

Microscopía Electrónica de Barrido (MEB)

Solo cambia respecto al MET en que el haz es móvil y la imagen se forma a partir de los electrones retrodispersados y secundarios.

Preparación de muestra para MEB

• Fijación: Formaldehído, paraformaldehído, glutaraldehído.
• Deshidratación.
• Punto crítico: Se basa en el principio de que, a ciertas condiciones de temperatura (Ta) y presión (P), un líquido iguala la densidad de su fase líquida y su fase vapor.
• Coloración.
• Metalización: Aumenta la conductividad.