Técnicas de Separación y Análisis Bioquímico: Cromatografía, Electroforesis y Más

Cromatografía

La cromatografía es una técnica destinada a separar los componentes disueltos de una muestra a medida que se desplazan por una matriz porosa. Se basa en el fenómeno de capilaridad y en la diferente afinidad que tienen las moléculas por el disolvente y por la trama porosa de la matriz a través de la que fluyen. Los componentes de la cromatografía pueden asociarse en dos fases: fase móvil (que contiene el disolvente) y la fase inmóvil (formada por una matriz porosa). Cuanto mayor sea la afinidad de la molécula por esta última, más lento será su avance a través de la misma, y viceversa.

La cromatografía ha ido progresando en la búsqueda de nuevos soportes porosos. Encontramos la cromatografía de capa fina, en columna y la cromatografía de alta resolución, que es una variante de la cromatografía en columna.

Electroforesis

La electroforesis tiene el mismo fundamento físico que la cromatografía (capilaridad y diferente afinidad), pero se lleva a cabo en presencia de un campo eléctrico. Las moléculas con carga eléctrica neta se separan según su capacidad para migrar en un campo determinado. La electroforesis se lleva a cabo con un soporte de gel de poliacrilamida o de agarosa, instalado en contacto con una disolución tampón. La disolución tampón tiene un pH diferente al del punto isoeléctrico de las proteínas para que mantengan su carga neta. Cerca de los extremos se aplica una pequeña cantidad de la muestra y se conectan los electrodos. Para visualizar las proteínas, se necesita un colorante. La migración proteica depende de su carga eléctrica.

Ultracentrifugación

La ultracentrifugación consiste en someter una mezcla homogénea de un tejido a una rotación con gran velocidad angular para que haya una gran fuerza centrífuga, lo que provoca que, aunque las masas de distintas partes sean muy similares, se sedimenten en tiempos diferentes, quedando los distintos compuestos sedimentados. Se establece la unidad Svedberg para clasificar los cuerpos sedimentados.

Técnica de Radioisótopos

Algunas sustancias conocidas como trazadores pueden manifestar su presencia de alguna forma, permitiendo a los científicos poder localizarlos en los experimentos. Los trazadores se marcan con radioisótopos radiactivos, confiriendo al átomo tendencia a fragmentarse para alcanzar configuraciones estables. La desintegración de un isótopo radiactivo libera energía y puede detectarse. Al desintegrarse, la radiactividad puede ser de tres tipos: partículas alfa, beta y radiación gamma.

Existen dos técnicas para la detección de la radiactividad:

• Espectrometría de centelleo líquido: Se basa en la propiedad de ciertas moléculas fosforescentes o centelleantes para absorber parte de la energía de una partícula y liberarla en forma de luz.
• Autorradiografía: Se utiliza para detectar radioisótopos inmovilizados dentro de un corte de tejido, tanto de microscopía óptica (MO) como de microscopía electrónica de transmisión (MET).

Sombreado Metálico

En el MET, se pueden conseguir imágenes que reflejen la textura superficial del material biológico mediante la técnica de sombreado metálico, que consiste en depositar una capa de oro y platino, evaporado al vacío. Un baño ácido disuelve el material biológico, dejando una réplica metálica que puede ser examinada con el MET.

Criofractura

La criofractura consiste en congelar la muestra rápidamente. Para evitar daños, la muestra se sumerge en compuestos crioprotectores. Las muestras de tejido congelado se fracturan, lográndose un plano de fractura o fisura. Acto seguido, se deposita una fina capa de un metal pesado con cierta inclinación para obtener una réplica. Finalmente, se deposita una capa de carbón que elimina el material celular. La réplica se observa con relieve en el microscopio.